【基本操作】大肠杆菌菌种培育技术

为了能够长期的保存大肠杆菌菌种且不破坏其结构，通常将含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80℃冻存。之所以选择甘油是因为甘油即使在超低温冻结的情况下其体积也不会产生剧烈变化，不会导致由于其冰冻后体积的改变而压迫菌种导致菌种结构的改变。等到需要的时候再将超低温冷冻的菌体，融化并培养即可。由于此时仅仅需要将菌种培养至符合其种子液的数量要求而无需考虑培养产物以及繁殖速度等问题，所以一般采用最基础的LB培养基即可。

LB培养基配方：胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4

液体培养基：

胰化蛋白胨 10.0g

酵母粉 5.0g

氯化钠 10.0g

水 1000ml

pH 7.4

固体培养基：在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂

物料处理：

物料通常采用烧杯进行称量主要是为了后续溶解方便并且不易外撒。

牛肉膏可采用小烧杯进行称量，称量后在进行溶解，避免与其他混合导致溶解困难。

蛋白胨由于其极易受潮故称量时需快速。

以上称量完成后，在上述烧杯中加入适量水进行加热，并充分搅拌。待所配置药品全部充分溶解的后，再加入适量水补足所需水分。

若需配置固体培养基则将称好的琼脂加入溶解液中并加热溶解，带加热后再补足所需水分。

Ps：琼脂溶解过程中注意不断搅拌防止糊底或加热过快导致溢出。

分装灭菌：将上述步骤所得培养基按所需规格进行分装并进行包装，后放入高压灭菌锅进行灭菌即可。灭菌完成后需将其至于烘干机内烘干直至包装的封口纸等干燥，即可进行后续的制版等操作。平板培养基制备完成后需倒置防止冷却水滴入培养基内。

如有剩余培养基剩余可将其储存于锥形瓶内进行保存，带须使用时再进行微波炉加热即可。

接种：

1.取制备大肠杆菌冻存液，管口用用酒精灯灼烧后方可打开。

2.接种方法一、用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。通常采用的方法为方法一。

3.具体操作步骤：

一、将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 3～5条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。

二、将菌液用移液枪在酒精灯旁接入锥形瓶内。此方法通常为确定菌种型号以及特性的情况下用于菌种繁殖。

Ps：平板划线时需注意将保持接种针与板面之间的角度为30°，且出第一次划线外其余均需将接种针与酒精灯上灼烧，消灭接种针上的残余菌种。

大肠杆菌培养：将接种完成的培养基放入恒温培养箱或恒温振荡培养箱内进行培养，即可得到所需的大肠杆菌菌落或种子液。