人结肠癌抗原(CCA)ELISA试剂盒实验原理

人结肠癌抗原(CCA)ELISA试剂盒使用目的：用于测定人血清、血浆及相关液体样本中结肠癌抗原(CCA)含量。

实验原理
人结肠癌抗原(CCA)酶联免疫试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人结肠癌抗原(CCA)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入结肠癌抗原(CCA)，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的结肠癌抗原(CCA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人结肠癌抗原(CCA)浓度。

试剂盒组成
1    30倍浓缩洗涤液    20ml×1瓶    7    终止液    6ml×1瓶
2    酶标试剂    6ml×1瓶    8    标准品（4800pg/ml）    0.5ml×1瓶
3    酶标包被板    12孔×8条    9    标准品稀释液    1.5ml×1瓶
4    样品稀释液    6ml×1瓶    10    说明书    1份
5    显色剂A液    6ml×1瓶    11    封板膜    2张
6    显色剂B液    6ml×1/瓶    12    密封袋    1个

标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤
1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2400pg/ml    5号标准品    150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
1200pg/ml    4号标准品    150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
600pg/ml    3号标准品    150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
300pg/ml    2号标准品    150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
150pg/ml    1号标准品    150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。