人激肽释放酶8(KLK 8)ELISA试剂盒实验原理

人激肽释放酶8(KLK 8)ELISA试剂盒仅供科研实验使用！

本试剂盒采用夹心法酶联免疫吸附法,用于体外定量分析人血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清中Kallikrein-8的含量。

检测原理:
预先包被的抗体和检测相抗体都是亲和纯化的Kallikrein-8多克隆抗体。检测相抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后,PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应;经过PBS或TBS的 洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Kallikrein-8呈正相关。

背景资料:
激肽释放酶(kallikrein)基因家族是编码丝氨酸蛋白酶的一组同源基因,串连排列在19q1314染色体上,包括KLK1~KLK15,它们都参与血 管张力与通透性的维持,各种生长因子的裂解和激活,调 节神 经系统可塑性以及皮肤表面细胞脱落与再生等众多生理过程。

基本参数:
检测指标:Kallikrein-8;KLK8
检测范围:156pg/ml~10000pg/ml
特异性:系统和其它细胞因子无交叉反应
敏感性:<5pg/ml

产品组成:
组分     规格     数量
预包被抗人Kallikrein-8抗体的96孔板     96T     1板
重组人Kallikrein-8标准品(冻干)     10ng/管     2管
生物素标记抗人Kallikrein-8(100X)     100μL     1管
亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)(100X)     100μL     1管
样品稀释液     30mL     1瓶
抗体稀释液     12mL     1瓶
ABC稀释液     12mL     1瓶
TMB显色液     10mL     1瓶
终止液     10mL     1瓶
洗涤缓冲液(25X)     20mL     1瓶
封板膜         4张
保存:2~8℃,有效期6个月。长期不用请置于-20℃可保存1年。

自备器材:
标准规格酶标仪。
自动洗板机。
恒温箱
系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时, 用多通道移液器。
干净的试管和Eppendof管。
用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍,成1X洗涤缓冲液。

注意事项:
使用前TMB显色液应为无色透明溶液,若发现颜色异常,请及时与我司联系。
用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。
要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
为免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和试管。
禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板,用户可按需求使用;剩余的酶标板请按保存条件贮存。
揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。

洗板方法:
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将1X洗涤缓冲液至少300μL注入孔内,浸泡1~2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样品准备:
样品如果不立即分析,应分装后冷冻保存,且避免反复冻融。
细胞培养上清:离心去除沉淀,立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血清:用干净试管收集血液,室温凝固30分钟,离心1000×g 15分钟,收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血浆:采用肝素或EDTA抗凝,抽血后30分钟内离心1000×g 15分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液,用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后,细胞就会被裂解。
悬浮细胞:离心收集细胞,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液,用枪吹打把细胞吹散,用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后,10000~14000g离心3~5分钟,取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

样品稀释:
用户须估计样品待测因子的含量,决定适当的稀释倍数,以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的 检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同,分别采取不同的稀释方案,以下方案仅供参考,样品的稀释应有详细记录。
高:指待测因子在100~1000ng/ml。一般按1:100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品。
中:指待测因子在10~100ng/ml。一般按1:10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
低:指待测因子在156–10,000pg/ml。按1:2稀释。100μL样品稀释液加100μL样品。
特低:指待测因子≤156pg/ml。样品一般不做稀释,或按1:2稀释。

试剂准备:
KLK8标准品的稀释和使用:在使用前2小时内准备。试剂盒提供2管标准品,每管10ng,每次使用1管。
配制10,000pg/ml标准品:取1mL样品稀释液加入标准品管内,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解。
配制5000pg/ml~156pg/ml标准品:准备6只Eppendorf管,每管加0.3mL样品稀释液,分别标记上5000pg/ml,2500pg/ml,1250pg/ml,625pg/ml,312pg/ml,156pg/ml。取0.3mL 10,000pg/ml的标准品加入标记5000pg/ml的管中,混匀后同样取出0.3mL,加入下一只管中。余同此类推,直到 一只样品管。
注意:已经稀释的标准品(10,000pg/ml),应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下,2天内可以使用,但不得反复冻融。
生物素标记抗人KLK8抗体工作液的准备:在使用前2小时内准备。
根据每孔需要100μL计算总的用量(实际配制时应多配制100~200μL)。
按1μL生物素标记抗人KLK8加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备:在使用前1小时内准备。
根据每孔需要100μL计算总的用量(实配时应多配制100~200μL)。
按1μL亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
注意:已稀释好的ABC应预先在37℃中平衡至少30分钟后加入孔内。

操作程序:
已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时,切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量,决定适当的稀释倍数。
确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目,并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9;做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。
将10,000pg/ml,5000pg/ml,2500pg/ml,1250pg/ml,625pg/ml,312pg/ml,156pg/ml的标准品各100μL依次加入一排7孔中,1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于人血清、血浆、细胞裂解液、细胞培养上清,直接加已用样品稀释液稀释的样品100μL。
酶标板加上封板膜,37℃反应90分钟。
反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体;或甩去酶标板内液体,再对着吸水纸拍几下。不洗。
将准备好的生物素抗人KLK8抗体工作液按每孔100μL依次加入。(TMB空白显色孔除外)。
酶标板加上封板膜,37℃反应60分钟。
1X洗涤缓冲液洗涤3次,每次浸泡1分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。
酶标板加上封板膜,37℃反应30分钟。
1X洗涤缓冲液洗涤5次,每次浸泡1~2分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液,37℃避光反应15~20分钟。
注意:显色时间供参考,因用户实验室条件差异, 显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3~4孔有明显的梯度蓝色,后3~4孔差别不明显。
按每孔100μL依次加入终止液,此时蓝色立转黄色。
用酶标仪在450nm测定O.D.值。
有两种设定空白对照的方案:
① 将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后,在坐标纸上画出曲线,以吸光值作为纵坐标,以浓度作为横坐标。
② 将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后,得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍,其实际浓度应该×N。

操作总结:
加样品和标准品,37℃反应90分钟。不洗。
加生物素标记抗体,37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。
加ABC,37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。
TMB 37℃反应15~20分钟。
加入终止液,读数。

参考数据:
取自某些批次质检数据,仅供参考,用户需要自己建立标准曲线。
浓度(pg/ml)     0     156     312     625     1250     2500     5000     10000
OD值     0.002     0.115     0.221     0.408     0.692     1.106     1.755     2.485