人胃蛋白酶(Pepsin)ELISA试剂盒实验步骤

人胃蛋白酶(Pepsin)ELISA试剂盒使用前仔细阅读本说明书。
本酶联免疫试剂盒是基于双抗体夹心技术原理，来检测人胃蛋白酶(Pepsin)，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。
用途：用于人血清、血浆及相关液体样本中胃蛋白酶(Pepsin)测定。

工作原理
本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中人胃蛋白酶(Pepsin)水平。向预先包被了人胃蛋白酶(Pepsin)单克隆抗体的酶标孔中加入人胃蛋白酶(Pepsin)，温育；温育后，加入生物素标记的抗胃蛋白酶(Pepsin)抗体。再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中人胃蛋白酶(Pepsin)的浓度呈正相关。

试剂盒组成
试剂盒组成48孔配置96孔配置保存
说明书1份1份
封板膜2片（48）2片（96）
密封袋1个1个
酶标包被板1×481×962-8℃保存
标准品400ng/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存
标准品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
链霉亲和素-HRP3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
生物素标记的抗PEPSIN抗体0.5ml×1瓶1 ml×1瓶2-8℃保存
显色剂A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
显色剂B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存

需要而未提供的试剂和器材
•37℃恒温箱。
•标准规格酶标仪。
•精密移液器及一次性吸头
•蒸馏水，
•一次性试管
•吸水纸
 
注意事项
•从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
•各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差
•严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
•为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。
•不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
•底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。
 
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中

标本要求
1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

操作程序
•标准品的稀释：(本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。)
200ng/ml5号标准品120μl的原倍标准品加入120μl标准品稀释液
100ng/ml4号标准品120μl的5号标准品加入120μl标准品稀释液
50ng/ml3号标准品120μl的4号标准品加入120μl标准品稀释液
25ng/ml2号标准品120μl的3号标准品加入120μl标准品稀释液
12.5ng/ml1号标准品120μl的2号标准品加入120μl标准品稀释液
 
•根据代测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
•加样：1）空白孔，空白对照孔不加样品，生物素标记的抗PEPSIN抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同；2）标准品孔：加入标准品50ul，链霉亲和素-HRP50ul(标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加)；3）代测样品孔：加入样本40ul，然后各加入抗PEPSIN抗体10ul、链霉亲和素-HRP50ul，盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃温育60分钟。
•配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
•洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
•显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
•终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
•测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
•根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。

试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。
2.批内与批间应分别小于9%和15%

检测范围：6ng/ml -200ng/ml
保存：2-8℃。
有效期：6个月(2-8℃)。