人热休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)ELISA试剂盒实验步骤

人热休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)ELISA试剂盒说明书
使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中热休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)的含量。上海远慕生物高品质ELISA试剂盒供应商，品质卓越，售后完善。欢迎垂询，并提供免费代检测服务。

本试剂仅供科研使用！

实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人热休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)水平。用纯化的人热休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入热休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)，再与HRP标记的热休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的热休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人热休克蛋白糖蛋白96(HSP gp96)浓度。

试剂盒组成：
试剂盒组成    48孔配置    96孔配置    保存
说明书    1份    1份    
封板膜    2片（48）    2片（96）    
密封袋    1个    1个    
酶标包被板    1×48    1×96    2-8℃保存
标准品：450pg/ml    0.5ml×1瓶    0.5ml×1瓶    2-8℃保存
标准品稀释液    1.5ml×1瓶    1.5ml×1瓶    2-8℃保存
酶标试剂    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存
样品稀释液    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存
显色剂A液    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存
显色剂B液    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存
终止液    3ml×1瓶    6ml×1瓶    2-8℃保存
浓缩洗涤液    （20ml×20倍）×1瓶    （20ml×30倍）×1瓶    2-8℃保存

样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤
1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为300 pg/ml，200 pg/ml ，100 pg/ml，，50 pg/ml， 25 pg/ml）。
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

注意事项：
1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2． 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。