流式细胞术介绍及实验常见问题

　　流式细胞术广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分离出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量，它可以同时分析单个细胞的多个参数。它主要用于检测标记在抗体上的荧光强度，这些荧光抗体则可以检测与特定细胞分子结合的蛋白或配体，如与 DNA 结合的溴化丙啶 (PI)等。

　　染色步骤包括：将培养的细胞或组织样品制成单细胞悬液，然后将细胞放入管子或酶标板中与荧光标记或未标记的抗体孵育。之后将细胞放入流式细胞仪中进行分析。

　　悬浮缓冲液中染色的细胞样品通过流式细胞仪时，由于鞘液的作用被限制在液流的轴线上，从而通过一个非常小的喷嘴。这种微小的"流液束"使细胞一个接一个地通过激光，细胞/粒子通过通道时散射的光线被多个探测器检测到。其中光柱前有一个检测器（称为前向角散射或简称 FSC），它的旁边有几个检测器（称为侧向散射或简称 SSC）。荧光检测器用于检测荧光染料本身。粒子/细胞通过光束时，将出现光线散射，散射会通过前向散射和侧向散射被检测到。散射和荧光数据会结合起来分析。其中前向角散射光与细胞的大小有关；而侧向角散射则依赖于粒子/细胞的密度（比如胞浆颗粒数量，细胞膜尺寸），并往往以这种方式，根据不同的大小和密度的差异而将细胞群区分开来。当由相应激发波长的激光激发时，用于检测或染色的荧光染料就会发光。这些粒子/细胞就可分别被检测并进行数据分析。

　　直接染色：

　　直接免疫荧光染色时，细胞与直接结合有荧光染料（如 FITC 标记）的抗体孵育。它的优点在于只需要抗体孵育这一个步骤，从而消除了来自二抗的非特异性结合的可能性。这对细胞内染色特别有用，由于大的抗体荧光分子复合物包括二抗被困在细胞内造成背景，或甚至无法进入细胞，阻止了一抗的检测。

　　间接染色：

　　间接染色时，一抗不是荧光染料直接标记的，而是通过荧光染料标记的二抗检测。另外可选择使用亲和-生物素系统，即抗体与生物素结合并且通过荧光染料标记的亲和素来检测。随着标记二抗越来越多的应用，可针对不同的目标蛋白制出未标记的一抗，然后用标记二抗进行流式细胞仪分析，这拓宽了研究者对目标蛋白的选择范围。

　　细胞内染色：

　　应用流式细胞术的细胞内源性抗原在染色时，应采取各种不同的固定和通透方法，以使抗体能接近胞内蛋白。

　　任何情况下，要获得成功的染色都必须对实验条件进行优化，包括测定抗体效价，采用合适的对照设定流式细胞仪，并且（如有必要）优化样品的固定和通透方法。

　　选择荧光结合染料

　　对一个给定的抗体，从阴性中分辨出阳性细胞的能力，往往取决于所用的荧光结合染料。

　　各种荧光染料相对强度的一般准则是，从zui亮到zui暗，PE（藻红蛋白），PE-Cy7，PE-Cy5，APC > APC- Cy7，Alexa Fluor 47，Alexa Fluor 700 > FITC，Pacifi c Blue，Alexa Fluor 488。这是使用信噪比的一般模式，但对于个别抗体仍有些差异。

　　一个高表达的抗原通常可以被几乎所有的荧光团分辨。一个低强度表达的抗原可能需要使用较亮的 PE 或APC，提信噪比，把未染色细胞中足够分离出阳性细胞。

　　荧光染料强度的相对差异取决于仪器，这是因为在不同的仪器上激光和过滤器的组合差异。一定要使用适当的FACS。

　　流式细胞术常见问题分析

　　无信号/荧光强度弱

　　不正确的信号补偿

　　检查流式细胞仪阳性单一颜色对照是否正确，通道和补偿设置是否能正确地捕获所有粒子。

　　没有足够的抗体来检测

　　增加抗体的量/浓度

　　无法接近细胞内目标

　　检查目标蛋白是否在细胞内。对于胞内染色，确保有足够的通透性。为防止细胞表面蛋白质的内化，该过程应用冰冷的试剂，在冰上或 4 °C进行，以终止一切反应。加入叠氮钠可防止表面抗原的修饰和内化带来的荧光强度的损失。对于细胞系染色，胰蛋白酶可以引起细胞表面蛋白质的内化，尤其是细胞表面分子，可能需要更温和的分离方法。

　　细胞内染色结合荧光分子太大

　　对细胞内染色实验，荧光分子应具有较小的分子量。大分子量荧光染料会降低抗体的动力和其进入细胞的可能性。

　　激光器未对齐

　　确保流式细胞仪的激光器正确对齐，必要时通过运行液流检查微球来调整路线。如果激光器不能正确对准或发生漂移时，您可能需要考虑此机的客服。

　　目标蛋白不存在或处于低水平表达，确保组织或细胞类型表达的目标蛋白处于一个足够检测的量。

　　可溶性或分泌型目标蛋白

　　目标蛋白是否可溶并从细胞内分泌？需要嵌合在细胞膜上或存在于细胞质里以便流式细胞仪能很容易检测到。通过高尔基体封闭的步骤，比如加入 Brefaldin A，可提高细胞内染色信号。

　　补偿过高或增益过低

　　使用阳性对照再次设置流式细胞仪，利用补偿以确保细胞的荧光信号不被切断，提高增益以增强信号（在合理的范围内）。

　　荧光分子的荧光逐渐消退，抗体可能放置时间太长或没有避光，新鲜抗体是必需的。

　　一抗和二抗不匹配

　　二抗应该是和一抗来源物种相同（例如*抗体来源于兔，就要使用抗兔的第二抗体）。

　　荧光强度过高

　　抗体浓度过高

　　这将导致较高的非特异性结合或非常高的荧光强度。减少每个样本中加入的抗体量。

　　过量抗体被困

　　这是细胞内染色特有的问题，较大的荧光分子使抗体被困在细胞中。确保洗涤步骤充分，包括在洗涤缓冲液中加入吐温或 Triton。

　　封闭不足

　　与封闭步骤一样，抗体中加入1-3% 封闭试剂。

　　背景高或阳性细胞百分比高

　　增益设置过高或补偿过低

　　使用阳性对照再次设置流式细胞仪，用补偿减少小颗粒背景并减少增益以降低信号。

　　抗体过量

　　降低抗体浓度。您还可以在洗涤缓冲液中添加去污剂，以确保洗去多余的抗体。观察到两个或多个细胞群但应该只有一群细胞不止一类细胞表达目的蛋白检查样品中所有细胞类型的预期表达水平，如果必要确保细胞充分分离。

　　出现细胞双峰

　　细胞双峰在图上显示两倍的荧光强度的第二种细胞类型。染色前轻轻地混合细胞，在放入流式细胞仪前用吸管再次混匀，也可以筛选或过滤细胞以除去团块（30 μm 的尼龙网）。

　　侧向散射背景偏高（来自小颗粒）

　　细胞裂解

　　确保样品中细胞没有裂解和破裂。样品应是新鲜的并且是正确制备的。细胞不能高转速离心或剧烈震荡。

　　细菌污染

　　确保样品不受污染。细菌会低水平自发荧光，这也会导致高粒子率。

　　低粒子率

　　每毫升的细胞数量太少 制备 1 × 10 6 个细胞/ml。确保细胞充分混合（操作要轻）。

　　细胞聚集，阻塞管道

　　染色前轻轻吹打几次确保形成同源单细胞悬液。确保运行之前再次混匀。在的情况下，可筛选或过滤细胞以去除团块（30 μm 的尼龙网）。