人游离前列腺特异性抗原(fPSA) ELISA试剂盒实验步骤

一、游离前列腺特异性抗原(fPSA) ELISA试剂盒实验原理
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗FPSA单抗包被于酶标板上，标准品与样品中的FPSA与单抗结合，加入生物素化的抗FPSA抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入酶底物TMB,出现蓝色，加终止液硫酸，颜色变黄，在450nm处测OD值，FPSA浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中FPSA浓度。
 
二、试剂盒组份
组份    48T    96T
酶标板(已包被抗FPSA)    48 孔    96 孔
样品稀释液    5 mL    5mL
第一抗体工作液    2.7ml    5.5ml
酶标抗体工作液    5.5ml    10.5ml
底物液    1 瓶    2 瓶
终止液    3ml    6ml
洗涤液(20×)    25 mL    50 mL
标准品（冻干粉，2000pg/ml）    1 管    2 管
坐标纸    1 张    1 张
封板纸    1 张    1 张

三、试剂盒以外自备仪器和试剂
1、标准品液配制：使用前每管中加入蒸馏水 400ul 溶解后即可。
2、洗涤液：用重蒸水 1:20 稀释。

四、注意事项
1. 以上标准孔及待查样品均建议做复孔，每次测定应同时制作标准曲线。
2. 底物液使用前建议先行检查，若溶液颜色发蓝则已失效，弃去。
3. 本试剂盒取出的试剂在室温条件下使用，溶液应轻轻摇匀后使用。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，这属于正常现象，加热使结晶完全溶解后再配制。
4. 本试剂盒含 2M 硫酸，不要将它与含叠氮化钠的废物混在一起。
5. 板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。
6. 不同批号的试剂盒组分不能混用。
7. 正确拿酶标板：不要接触板的底部，否则会影响度数。

五、操作方法
1. 实验前 20 分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温（20-25℃）；
2. 取出所需数量的板条，其余密封放回 4℃；
3. 建立标准曲线：设标准孔 8 孔，每孔中各加入样品稀释液 100ul，第一孔加标准品 100nl，混匀后用加样器吸出 100ul，移至第二孔。如此反复对倍稀释至第七孔，最后，从第七孔中吸出 100ul 弃去，使之体积均为 100ul。第八孔为空白对照；
4. 加样：待测品孔中每孔加入待测样品 100ul；
5. 将反应板置 37℃120 分钟；
6. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次，向滤纸上印干;
7. 每孔中加入第一抗体工作液 50ul;
8. 将反应板充分混匀后置 37℃60 分钟。
9. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次，向滤纸上印干;
10. 每孔加酶标抗体工作液 100uL. 11. 将反应板置 37℃60 分钟。
12. 洗板：同前。
13. 每孔加入底物液 100uL，置 37℃暗处反应 5-10 分钟。
14. 每孔加入 50uL 终止液混匀。
15. 在 450nm 处测吸光值。（应尽快，时间过长可能导致本底偏高）

结果计算与判断：
1.所有 OD 值都应减除空白值后再计算；
2.以标准品 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、0pg/ml 之 OD 值在半对数纸上作图，画出标准曲线，将浓度作为 X 轴（对数轴），OD 值作为 Y 轴（线性轴）。曲线应为一光滑曲线。
3.根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应fPSA含量。

六、样品的准备和保存
样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
1、血清：用干净试管收集血液，室温凝固 30 分钟，离心 1000×g15 分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
2、血浆：采用 EDTA 抗凝，抽血后 30 分钟内离心 1000×g15 分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
3、细胞培养、组织匀浆、体液：离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

七、性能参数
产品名称：人游离前列腺特异性抗原(fPSA) ELISA试剂盒
简称：fPSA试剂盒
规格：96T/48T
检测范围：78.125-5000pg/mL
检测限：25.4pg/mL
重复性：板内变异系数＜10%
板间变异系数＜15%