实时荧光定量PCR探针法技术原理解析

目前主流的实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）方法分为染料法和探针法，染料法以SYBRGreen法为代表，SYBRGreen染料游离时荧光微弱，但但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强，反应管中的荧光强度与反应管中双链DNA的数量成正比例关系，因此荧光定量pcr实验步骤可以通过检测荧光计算反应管中产生的双链DNA（PCR产物）的量，但该方法没有特异性，非特异性扩增的产物也会被计入。

对于探针法来说，反应管中的荧光强度也是检测PCR产物量的依据。但其发光机制却与染料法完全不同。
一、荧光

是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的波长长的出射光。

其原理为：光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。

（紫外验钞的原理就是利用了经漂白处理后的纸张在紫外线(波长为365nm的蓝光)的照射下会衍射出波长为420460nm的蓝光

二、荧光共振能量转移fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)

荧光物质间存在一种现象，如果一个荧光基团（称为供体Donor）的发射光谱与另一个基团（受体Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当二者的距离接近到一定程度（1-10nm）供体被激发光激发但是却不发出该物质的发射光，而是将能量转移至受体，整个能量转移的过程中由一对偶极子介导，不涉及光子的发射和重新吸收。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭（即供体荧光被受体淬灭）；如果受体也是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红移。

三、qPCR探针法的本质

目前所有的探针法qPCR的理论基础都是利用了荧光共振能量转移现象，探针上存在一对能产生荧光共振能量转移的基团，利用PCR反应中的一些过程（酶切，杂交等），使两个基团的距离产生变化，使系统中的荧光强度或者荧光种类发生变化，这种变化又与PCR产物的种类和量有直接关系，通过检测这种变化，我们就可以检测出PCR反应体系中产物的种类和量。

四、几种qPCR探针法

1、Taq-Man探针：Taq-Man探针法是最经典的探针方法，设计一条与扩增产物能互补杂交的探针，在探针的5’端标记荧光基团（供体），在探针3’端标记淬灭基团（受体），当探针完整时，荧光基团和淬灭基团距离很近（探针长度）因荧光共振能量转移，荧光基团在入射光激发下不发出荧光。PCR反应进行时，探针杂交在扩增产物上，当引物介导的延伸反应到达探针位置时，因taq酶拥有5’-3’的外切酶活性，会从5‘端切割（水解）探针，从而使5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团分离，使它们的间距超过10nm，超出荧光共振能量转移的范围，荧光基团此时在合适入射光的作用下，就能发出自身波长的荧光。探针杂交是特异性的，所以荧光的种类和量能特异性的代表目标产物的种类和量。

近年来对Taq-Man探针进行改良发展出TaqMan-MGB探针，在Taq-Man探针的3端加入一个能插入DNA小沟的二氢环化吲哚卟啉-三肽（DPI3），可以使大大提高探针的TM值，增加杂交反应的特异性。

2、双杂交探针（dualhybridizationprobe）：与Taq-Man法不同，双杂交探针的供体基团和受体基团分别在两条探针上，这两条探针都可以与扩增产物杂交，杂交位置不同但很接近，反应时两条探针一头一尾杂交于扩增产物上，杂交后两个基团距离在10nm以内（一般1-5碱基），此时产生荧光共振能量转移现象，激发光下供体基团不发光，受体基团发光，检测受体基团的发光情况既可以确认扩增产物的情况。

3、分子信标探针（molecularbeacon，MB）：分子信标探针采用的是在反应中增加荧光基团和淬灭基团距离的方法，和Taq-Man法不同，分子信标探针不是采用酶切的方式使荧光基团和淬灭基团分离，而是通过杂交的方式改变探针二级结构，增加两个基团的距离从而使荧光基团发光。

分子信标探针在与靶序列杂交前呈现一个茎环结构，其中环部分为能与靶序列互补杂交的特异性序列，臂部分互补，荧光基团和淬灭基团分别在两臂的末端，当分子信标探针呈茎环状态时，荧光基团和淬灭基团距离极近，荧光基团被淬灭。

当PCR扩增反应产生靶序列产物，探针环部分与靶序列发生杂交，两臂距离因此拉开，两个基团间的距离不能形成荧光共振能量转移，荧光基团发光。

4、蝎形探针（scorpion）：蝎形探针又叫蝎形引物，因形状类似蝎子而得名，其基本原理与分子信标探针十分类似，不同点在于，蝎形探针3’端带了PCR引物，反应中得到的产物与蝎形探针为一个分子，探针的杂交在分子内部，而不需要两个分子参与，从而使杂交反应更加迅速，高效。