人基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)ELISA试剂盒说明书

人基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)ELISA试剂盒应用：用于人血清、血浆或其他相关生物液体中基质金属蛋白酶组织抑制因子1的测定。

实验原理：
本试剂盒采用的是双抗体夹心法酶联免疫吸附检测技术（ELISA）。测定样品中人基质金属蛋白酶组织抑制因子1水平。向预先包被了抗人基质金属蛋白酶组织抑制因子1抗体的酶标孔中，加入标准品和样本，温育后，加入生物素标记的抗基质金属蛋白酶组织抑制因子1抗体。再与HRP标记的链霉亲和素结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入显色底物TMB，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。最后，在450 nm处测定反应孔样品吸光度（OD）值，样本中的人基质金属蛋白酶组织抑制因子1浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线计算出样本中人基质金属蛋白酶组织抑制因子1的浓度。
 
自备材料
1)蒸馏水。
2)加样器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3)振荡器及磁力搅拌器等。

样品收集、处理及保存方法
1)血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2)血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3)细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4)组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟,取上清液
5)保存------如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70 ℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂的准备
1)标准品:标准品的系列稀释应在实验时准备,不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。
2)洗涤缓冲液(50×)的稀释:蒸馏水50倍稀释。

操作步骤
1)使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。
2)根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1:1稀释后加入50ul于反应孔内。
3)加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育1小时。
4)甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
5)每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟。
6)甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
7)每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育10分钟。避免光照。
8)取出酶标板,迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果。
9)在450nm波长处测定各孔的OD值。

局限
6号标准品以上的结果为非线性的,根据此标准曲线无法得到精确的结果。

安全性
1)避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗。
2)实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3)不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

性能
1. 灵敏度:最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
2. 特异性:不与其它细胞因子反应。
3. 重复性:板内、板间变异系数均小于10%。

结果判断与分析
1、仪器值:于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值
2、以吸光度OD值为纵坐标(Y),相应的待测物质标准品浓度为横坐标(X),做得相应的曲线,样品的待测物质含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。