人乙型肝炎表面抗原 HBsAg ELISA试剂盒实验步骤

人乙型肝炎表面抗原（HBsAg）ELISA检测试剂盒试验原理：
HBSAG试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知HBSAG浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将HBSAG和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中HBSAG的浓度呈比例关系。

试剂盒内容及其配制：
试剂盒成份    96孔配置    48孔配置
96/48人份酶标板    1块板（96T）    半块板（48T）
塑料膜板盖    1块    半块
标准品：500pg/ml    1瓶（1.0ml）    1瓶（0.5ml）
空白对照    1瓶（1.0ml）    1瓶（0.5ml）
标准品稀释缓冲液    1瓶（8.0ml）    1瓶（4.0ml）
生物素标记的抗HBSAG抗体    1瓶（8.0ml）    1瓶（4.0ml）
亲和链酶素-HRP    1瓶（12ml）    1瓶（5ml）
洗涤缓冲液    1瓶（20ml）    1瓶（10ml）
底物A    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）
底物B    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）
终止液    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）

自备材料：
1.蒸馏水。
2.加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3.振荡器及磁力搅拌器等。

样品收集、处理及保存方法：
1、血清……操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。
2、血浆……EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、细胞上清液……1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、组织匀浆……将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。
5、保存……如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

操作注意事项：
●试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
●实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
●不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
●使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
●使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
●底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
●加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
●按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。


安全性：
1.避免直接接触终止液和底物A、B，一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2.实难中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3.不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

试剂的准备：
1.标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：
500
pg/ml    （6号标准品）    原倍浓度不用稀释直接加入50ul
250
pg/ml    （5号标准品）    100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
125
pg/ml    （4号标准品）    100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
62.5
pg/ml    （3号标准品）    100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
31.2
pg/ml    （2号标准品）    100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
15.6
pg/ml    （1号标准品）    100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
0
pg/ml    （空白对照）    原倍浓度不用稀释直接加入50ul

2.洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。

试剂盒性能：
1.灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
2.特异性：不与其它细胞因子反应。
3.重复性：板内、板间变异系数均小于10%。

操作步骤：
1.使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3.加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。
4.甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5.每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6.甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7.每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。
8.取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9.在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断与分析：
1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值
2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的HBSAG标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的HBSAG含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
3、检测值范围：0-500pg/ml
4、敏感度：1.95pg/ml