质粒克隆载体的设计与构建原则

2024-05-06 10:08 来源：上海远慕生物试剂

为了构建表达质粒的克隆载体，必须组装合适的启动子，当设计真核生物的基因须在原核生物中表达式，常改用原核生物或病毒(噬菌体)基因的启动子，而原核生物基因在真核细胞中表达时，仍可用原核生物基因的启动子。

质粒克隆载体的设计和构建的原则

①选择合适的出发质粒

出发质粒也叫亲本质粒，它应含有质粒克隆载体必备的元件，如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子等。

②正确获得构建质粒克隆载体的元件

一般采用限制性核酸内切酶切割出质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA--片段，还可以采用PCR技术从靶DNA中扩增出含某种元件的特异性DNA--片段。

③组装合适的选择标记基因

构建的质粒克隆载体应该组装什么样的选择标记基因，必须根据要转化的受体细胞的特性来决定。

④选择合适的启动子

为了构建表达质粒的克隆载体，必须组装合适的启动子，当设计真核生物的基因须在原核生物中表达式，常改用原核生物或病毒(噬菌体)基因的启动子，而原核生物基因在真核细胞中表达时，仍可用原核生物基因的启动子。

质粒载体的分类

按复制形式

分为严紧型和松弛型复制。

根据质粒DNA复制与宿主之间的关系或在宿主细胞的拷贝数的多少，可以将质粒分为两种不同的复制类型：严紧型和松弛型。严紧型质粒复制受宿主染色体DNA复制的严格控制，拷贝数较小一般只有1~3个拷贝。疏松型质粒的复制宿主的控制比较松，在宿主中的拷贝数比较多，一般有10~200个拷贝，有时可达到700个。

按基因转移性

分两类：（1）传递性质粒：常为大型、严紧型质粒；

（2）非传递性质粒：多为小型、松弛型质粒。

按遗传性状、产物分类

（1）抗生素抗性：如氨苄西林、氯霉素抗性；

（2）限制酶-修饰酶（R-M）系统：如hsdR-菌株可使DNA甲基化，但不限制外源DNA；hsd-菌株为限制和甲基化双缺陷型。

人工构建的质粒载体分类

高拷贝数的质粒载体

ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。适合大量增殖克隆基因，或需要大量表达的基因产物。

低拷贝数的质粒载体

由 pSC101派生来的载体特点是分子量小的拷贝数。它有特殊的用途：当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌的死亡时，就需要低拷贝的载体。

失控的质粒载体

这是一类温度敏感型复制控制质粒。如pBEU1、 pBEU2。

插入失活型克隆载体。载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42。

正选择的质粒载体

直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。

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