细菌的芽孢染色(spore staining)实验步骤

实验原理
细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。

实验器材
1.活材料
培养36小时的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）。
2.染色液和试剂
5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液。
3.器材
小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。

实验方法
1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法
（1）制备菌液：加1—2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2—3环的菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。
（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液2—3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
（3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热15—20min。
（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。
（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。
（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
（7）复染：加蕃红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。
（8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。
结果：芽孢呈绿色，芽孢囊和菌体为红色。

2.Schaeffer与Fulton氏染色法
（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成涂片。
（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2—3次。
（3）染色：
①加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持 15-20min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。
②水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。
③复染：用蕃红液染色5min。
（4）水洗、晾干或吸干。
（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽孢和菌体的形态。
结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。

注意事项
1.供芽孢染色用的菌种应控制菌龄。
2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优越，可优先使用。
3.用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。