慢病毒感染目的细胞实验步骤

1. 感染预实验

以 24 孔培养板为例，同时进行目的细胞和工具细胞的感染预实验。工具细胞可选择 293T（人胚肾上皮细胞）、H1299（人肺癌细胞）或其它细胞。实验材料：培养基、24 孔培养板，移液枪，枪头， EP 管，细胞计数板、冰盒、废液缸等。（根据目的细胞情况，可酌情使用 Polybrene） Day1：

准备细胞：培养细胞至对数生长期，细胞以胰酶消化计数后，用细胞计数测出细胞密度，每孔接种 5×104 个细胞，添加细胞培养液至 500µL。通常情况下，该接种量的 H1299 或 293T 细胞在感染后第 3 天可生长至 80%-90% 融合度。（接种目的细胞时，请根据细胞的实际生长速度调整接种量，使目的细胞感染后第 3 天生长至 80%-90% 融合度）

Day2：

（1）准备慢病毒颗粒：计算所需慢病毒颗粒的量，将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出，冰浴融化；

（2）感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度；如细胞状态较好，则开始实验：

A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液，加入新的完全培养液；

B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平置于工作台上，以划 8 字的方式轻柔混匀；

C. 混匀后，细胞培养板置于 37℃、5% CO2 培养箱，过夜培养。

Day3：

更换培养液：感染 12-16 小时后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新向培养板添加含 5% 灭活 FBS（胎牛血清）的培养液，继续培养。（目的细胞需要调整感染时长，部分细胞不可感染超过 12 小时。）

Day4：

继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常。

Day5：

观察（评估）慢病毒颗粒感染效率：盖紧 24 孔培养板，使用 70% 乙醇清理培养板外壁，在倒置荧光显微镜观察荧光，拍照并估计慢病毒颗粒对细胞的感染效率。（如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需的时间较长，荧光表达所需时间也较长，建议感染 72、96 小时后观测荧光表达。）

根据荧光情况，可以初步从 MOI 梯度摸索实验中，找出目的细胞的 MOI 值。