单、多克隆抗体及抗原的选择方法

多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆，产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

一、单多抗优缺点

多克隆抗体优点

1.多克隆抗体有助于放大低表达水平的靶蛋白信号；

2.能识别多个表位；

3.比单克隆抗体更能容许抗原中的微小变化；

4.识别出与免疫原蛋白质具有高同源性的蛋白质，或者从非免疫原物种的组织样品中筛选靶蛋白；

5.多克隆抗体通常是检测变性蛋白质的首选；

6.多表位通常可提供更为有力的检测。

多克隆抗体缺点

1.易于产生批次间差异；

2.产生大量非特异性抗体，有时可能在某些应用中产生背景信号；

3.不适用于探测抗原的特定结构域，因为抗血清通常可识别多个结构域。

单克隆抗体优点

1.杂交瘤制得后，就成为了恒定的再生源，所有批次都将相同；

2.切片和细胞染色造成的背景较低。

3.具有特异性，适于分析测定中的一抗或检测组织中的抗原，并且通常所产生的背景染色显著低。

4.同质性非常高；

5.单克隆抗体的特异性能使其在混合物中和抗原高效地结合。

单克隆抗体缺点

1.可产生大量特异性抗体，但可能特异性过强；

2.经过抗原的化学处理后比多克隆抗体更易于丢失表位。这可通过使用同一抗原的两个或多个单克隆抗体进行补偿。

二、单抗和多抗的选择

如果对抗体的特异性要求高，用量较大或需要长期使用一致的抗体，制备的抗体应用要求多（WB/IP/IF/ICC等)，可以选择制备单克隆抗体。

多克隆抗体的特异性较差，即使是使用相同的抗原制备多抗，不同批次间也会存在差异，因而在特异性、一致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫检测时，更容易造成背景，例如在WB 中有杂带，在IHC 中背景较深等等。虽然还存在着交叉反应的问题，但由于多抗识别多个抗原表位，即使是有少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变，实验的结果也不会受到影响。另外多抗需要免疫原的量大，如果免疫原制备困难，建议制备单抗。

若对抗体的特异性要求不高，需要做沉淀和凝集反应的检测性实验或者只需做ELISA检测，可以选择制备多克隆抗体。

多抗相比较单抗仍然有制备时间短、首次制备成本低的特点，在一些情况下也是一种选择。另外，在相同条件下，使用多抗可以提高检测的灵敏度，对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。

三、抗原的选择

抗原的选择可以是天然蛋白、重组可溶蛋白、重组变性蛋白和多肽，抗原质量越高，最终制备高质量抗体的几率也会越大！ 目前抗体制备常采用重组蛋白或多肽作为抗原。

常规情况下，重组蛋白作为抗原往往含有更多的抗原决定簇，既有空间表位，也会有线形序列表位，对于机体的免疫刺激也会相对充分一些，那么最终获取应用面较广的抗体几率也会大很多，尤其是目的蛋白已证明有修饰或者复杂结构的，一般都会优先选择重组蛋白。

当然也有必须用多肽制备的，比如对同源家族某一个蛋白抗体的制备，同源性非常高的，需要找到特异性aa合成多肽，再或者一些修饰化抗体，需要在多肽合成阶段定点修饰某些AA来制备抗体。

抗原多肽选择一般遵循如下基本原则

1.尽可能是在蛋白表面；

2.保证该段序列不形成α-helix；

3.N，C端的肽段比中间的肽段更好；

4.避免蛋白内部重复或接近重复段的序列；

5.避免同源性太强的肽段；

6.交联可以交联在N，C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端；

7.序列中不能有太多的Pro，但有一两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。