流式细胞术原理与应用详解

　　研究实验中，我们常常用到一个高大上的仪器――流式细胞仪，而与之相对应的就是流式细胞术，可是大家对它们都了解多少呢？今天远慕就带着大家好好地认识一下。
　　
　　流式细胞术
　　
　　流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术。其特点是:第一，只要样本制备成单个细胞或生物颗粒悬液均可以分析。第二，测量速度快，每秒中可以测量数千个乃至数万个细胞。第三，同时测量每个细胞的多参数特征。第四，在进行细胞特征分析的同时可以把指定特征的细胞分离出来，以便对特定细胞做进一步培养、克隆化、观察或进行某些实验，这就是分选技术。
　　
　　那么，具体是如何通过FCM实现分选的呢？
　　
　　1、首先，制备单细胞悬液
　　
　　将待测细胞或微粒制成单细胞悬液，经特异性荧光染料标记抗体进行染色，在恒定气体的压力下进入流动室，不含细胞或微粒的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流形成一定角度，鞘液包绕着样品高速流动，组成一个圆柱形的液流束，待测细胞或微粒在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
　　
　　2、其次，收集单细胞上的荧光信号
　　
　　流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，细胞或微粒上的荧光染料被激发，产生散射光和激发荧光。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
　　
　　3、再次，统计结果
　　
　　荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质的浓度，经光电转换变为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机上。
　　
　　4、最后，做细胞分选
　　
　　细胞的分选是指根据所测定的各个参数将指定的细胞从细胞群体中分离出来的一种方式，通过分离含有单细胞的液滴实现。在流动室的喷口上方配有一个超高频的压电晶体，产生的振动使喷出的液流形成均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
　　
　　流式细胞术动用了现代多科高技术，能够同时定量检测检测单个细胞的多项指示，显示出无比优越性，已经广泛应用于细胞生物学、免疫学、临床医学、基础科学研究、海洋生物以及分选应用等研究领域。
　　
　　这么高级的单细胞统计仪器，到底能做哪些实验呢？
　　
　　比如，细胞计数标记可以帮助分析细胞，我们以此为例说明流式细胞仪的应用。
　　
　　如图，一个点表示一个细胞，纵坐标表示荧光散射，将细胞分散开；横坐标表示荧光强度，荧光强度越强，结合的抗体越多，表达的NKp46越多，说明该表达Nkp46的细胞群为NK细胞。结果显示： 在C57BL/6小鼠的脾脏和血液中均可检测到NKp46的表达；在B-NDG小鼠中未检测到NKp46的表达，表明B-NDG小鼠中没有NK细胞。
　　
　　T细胞、B细胞和NK细胞的检测
　　
　　取BALB/c、NOD-scid和B-NDG小鼠的外周血细胞，并通过流式对比其中T 、B和NK细胞的组成（A）并进行统计对比（B）。图3A横坐标/纵坐标都表示荧光强度，荧光强度越强，抗体表达量越多，则表达这些marker的相应细胞存在。B-NDG小鼠CD3、CD19和NKp46的相对应区域没有荧光，说明B-NDG小鼠中表达CD3、CD19和NKp46的成熟T,B和NK细胞不存在。结果：B-NDG®小鼠外周血中缺乏成熟的T细胞、B细胞和NK细胞。