人甲状腺非肽激素抗体(THAA)ELISA试剂盒应用方法

使用目的: 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中甲状腺非肽激素抗体(THAA)含量。

实验原理:
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中甲状腺非肽激素抗体(THAA)水平。用纯化的人甲状腺非肽激素抗体(THAA)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入甲状腺非肽激素抗体(THAA),再与 HRP 标记的甲状腺非肽激素抗体(THAA)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过 洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的甲状腺非肽激素抗体(THAA)呈正相关。用酶/标/仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值),通过标准曲线计算样品中人甲状腺非肽激素抗体(THAA)浓度。

试剂盒组成
1     30倍浓缩洗涤液     20ml×1瓶     7     终止液     6ml×1瓶
2     酶标试剂     6ml×1瓶     8     标/准品     0.5ml×1瓶
3     酶标包被板     12孔×8条     9     标准品稀释液     1.5ml×1瓶
4     样品稀释液     6ml×1瓶     10     说明书     1份
5     显色剂A液     6ml×1瓶     11     封板膜     2张
6     显色剂B液     6ml×1/瓶     12     密封袋     1个

标本要求
1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融
2.不能检测含NaN3 的样品,因 NaN3 抑制/辣/根/过/氧/化/物/酶的(HRP)活性。

操作步骤
1. 标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
5 号标准品     150μl 的原倍标准品加入 150μl 标准品稀释液
4 号标准品     150μl 的 5 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
3 号标准品     150μl 的 4 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
2 号标准品     150μl 的 3 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
1 号标准品     150μl 的 2 号标准品加入 150μl 标准品稀释液

2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50μl,待测样品孔中先加样品稀释液 40μl,然后再加待测样品 10μl(样品最终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3.温育:用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。
4.配液:将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用
5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。
6.加酶:每孔加入酶标试剂 50μl,空白孔除外。
7.温育:操作同 3。
8.洗涤:操作同 5。
9.显色:每孔先加入显色剂 A50μl,再加入显色剂 B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15 分钟.
10.终止:每孔加终止液 50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11.测定:以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。
 
计算
以标准物的浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的 OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

注意事项
1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间 控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4.请每次测定的同时做标准曲线, 做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD 值大于标准品孔 孔的OD 值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n 倍)后再测定,计算时请 乘以总稀释倍数(×n×5)。
5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物请避光保存。
7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶/标/仪读数为准.
8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9.本试剂不同批号组分不得混用。
10.如与英文说明书有异,以英文说明书为准。

试剂盒条件及有效期
1.试剂盒保存:2-8℃。
2.有效期:6 个月