人抗红细胞抗体(RBC)ELISA试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用

产品名称:人抗红细胞抗体(RBC)Elisa试剂盒
产品规格:48T/96T

实验原理
TPO-Ab试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知TPO-Ab浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将TPO-Ab物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中TPO-Ab的活性浓度呈比例关系。

试剂盒内容及其配制
试剂盒成份（2-8℃保存）    96孔配置    48孔配置    配制
96/48份酶标板    1块板（96T）    半块板（48T）    即用型
塑料膜板盖    1块    半块    即用型
标准品：400ng/ml    1瓶（0.6ml）    1瓶（0.3ml）    按说明书进行稀稀
空白对照    1瓶（1.0ml）    1瓶（0.5ml）    即用型
标准品稀释缓冲液    1瓶（5ml）    1瓶（2.5ml）    即用型
生物素标记的TPO-Ab抗体    1瓶（6ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
亲和链酶素-HRP    1瓶（10ml）    1瓶（5.0ml）    即用型
洗涤缓冲液    1瓶（20ml）    1瓶（10ml）    按说明书进行稀释
底物A    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
底物B    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型
终止液    1瓶（6.0ml）    1瓶（3.0ml）    即用型

自备材料
1．  蒸馏水。
2．  加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3．  振荡器及磁力搅拌器等。

安全性
1．  避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2．  实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3．  不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
 
操作注意事项
1．  试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2．  实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3．  不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4．  使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5．  使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6．  洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7．  底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
8．  加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9．  按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
 
标本要求
1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融
2.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

操作步骤
1． 使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
7. 温育:操作同3。
8. 洗涤:操作同5。
9. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟.
10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11. 测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

注意事项
1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类,如果要做复孔,标本量收集体积=100ulx检测种类x2
2、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C,若不及时检测,请进行分装,冻存于-20°或-80°C,避免反复冻融
3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围,建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。
4、血清标本采集是应注意避免溶血,红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质,溶血标本可能会增加非特异性显色
5、为了保证尿液检测的准确性,必须正确收集尿液标本和保存,收集尿液的容器必须要清洁干燥, 使用一次性的容器,避免因用药并清洁不到而造成的污染,尿液样本必须新鲜,留取后,应及时检测或保存
6、标本宜在新鲜是检测如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久,其中可能发生聚合,间接法ELISA中乐视本底加深,
7、反复冻融会使蛋白效价降低,所以待测样本如需多次检测,宜少量分装冻存。

计算
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

储存有效期
1.试剂盒保存:;2-8℃。
2.有效期:6个月