PCR反应出现假阳性的原因及对策

菌落PCR出现假阳性的原因：可能使用了错误的PCR鉴定引物、样品间交叉污染、PCR试剂的污染、PCR扩增产物的污染、气溶胶污染以及实验室中克隆质粒的污染。‌


‌1.使用了错误的PCR鉴定引物‌：


在进行菌液PCR时，如果使用了基因特异引物，可能会从游离的目的片段DNA上扩增出条带，而不是从重组质粒上，导致假阳性结果。推荐使用一对载体通用引物进行菌液PCR鉴定，以减少假阳性的发生‌。


2. ‌样品间交叉污染‌：


样品污染可能由于收集样本的容器被污染、样本放置时密封不严溢于容器外、容器外粘有样本而造成相互间交叉污染。此外，样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染也可能导致标本间污染‌。


‌3.PCR试剂的污染‌：


在PCR试剂配制过程中，加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染，也是造成假阳性的原因之一‌。


‌4.PCR扩增产物的污染‌：


PCR反应中最主要最常见的污染问题是PCR扩增产物污染。极微量的PCR产物污染就可形成假阳性‌。


‌5.气溶胶污染‌：


在空气与液体面摩擦时可形成气溶胶，剧烈地摇动反应管、开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题‌。


‌6.实验室中克隆质粒的污染‌：


由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，且在纯化过程中需用较多的用具及试剂，活细胞内的质粒具有很强的生命力，其污染可能性也很大，这也是造成假阳性的一个重要原因‌。


为了避免假阳性的出现，应采取适当的措施减少上述各种污染的可能性，如使用正确的PCR鉴定引物、严格操作规范、避免交叉污染等‌。