常规的PCR反应体系所需试剂和仪器

1.常规的PCR反应体系所需试剂

①高压过的超纯水(高压的目的是使其中的 DNase失活,以免降解模板DNA);

②PCR缓冲液(选用与所用聚合酶对应的缓冲液) ；

③4种dNTP混合物(每种dNTP的浓度为2.5mmol/L);

④引物(引物合成后,用超纯水稀释为10mmol/L);

⑤热稳定的DNA聚合酶(不同厂家、不同批次的酶可能会有差异);

⑥DNA模板(尽量使用纯化后的核酸作为模板)。

2.实验仪器

PCR热循环仪、核酸电泳仪、凝胶成像设备、离心机等

PCR实验操作注意事项

尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：

(1)戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套。

(2)使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。

(3)避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。

(4)操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。

(5)最后加入反应模板，加入后盖紧反应管。

(6)操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性。

(7)尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区。

(8)重复实验，验证结果，慎下结论。