【PCR检测】病原微生物检测操作方法

多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板，然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物，引物分别与待扩增DNA片段的两端互补，经55℃低温退火，引物与模板互补结合。在72℃条件下，结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反应体系中的4种dNTP为原料，按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。经过20-30个周期后，特异的目的DNA可扩增百万倍以上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。

PCR方法操作简便，灵敏度高，可检测出少至0.1pg的目的DNA。目前已广泛应用于多种病原微生物及寄生虫的检测。

【材料】

1．无菌双蒸水、石蜡油、溴化乙锭

2．10×PCR反应缓冲液

3．25mmol dNTP混合液

4．引物1，引物2各50pmol／u1

5．模板DNA

6．5U／ul Taq DNA聚合酶

【仪器】

1．PCR扩增仪

2．电泳仪

3．紫外线分析仪

【方法】

1．在0.5m1EP管中，加入以下成分：

10×PCR反应缓冲液5u1

引物1 2ul

引物1 2ul

模板DNA 10u1

dNTP混合液4ul

Taq DNA聚合酶1ul

无菌双蒸水加至50ul

混匀,加50 ul石蜡油，防止样品水分蒸发。

2．将反应管置于PCR仪中，94℃变性4min。然后按94℃变性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min，循环35次后，72℃延伸10 min。

3．反应完成后，取l0ul PCR扩增液，加至2％琼脂糖凝胶中进行电泳，电压100V，电泳30~60min后，置紫外线分析仪下观查扩增结果。