人促甲状腺素(TSH)ELISA试剂盒使用说明书

人促甲状腺素(TSH)ELISA试剂盒
本试剂仅供研究使用

试验原理：
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的抗原会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗体与结合在包被抗体上的抗原结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，原浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中指标的浓度。

试剂盒内容及其配制
试剂盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制
96/48份酶标板1块板（96T）半块板（48T）即用型
塑料膜板盖1块半块即用型
标准品：400ng/ml 1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按说明书进行稀稀
空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型
标准品稀释缓冲液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型
生物素标记PROG抗体1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型
亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型
洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按说明书进行稀释
底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型
底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型
终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型

自备材料
1. 酶标仪（450nm）
2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒温箱
4. 蒸馏水或去离子水

安全性
1．避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2．实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

注意事项
1．试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9．按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

样品收集、处理及保存方法
1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2、血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3、细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂的准备
1．标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：
400ng/ml（6号标准品）原倍浓度不用稀释直接加入50ul。
200ng/ml（5号标准品）100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
100ng/ml（4号标准品）100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
50ng/ml（3号标准品）100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
25ng/ml（2号标准品）100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
12.5ng/ml（1号标准品）100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
0ng/ml（空白对照）原始浓度不用稀释直接加入50ul。
2．洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。

操作步骤
1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。
3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5．每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

性能
1.灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
2.特异性：不与人其它细胞因子反应。
3.重复性：板内、板间变异系数均小于10%。
4.局限性：6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。

结果判断与分析
1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值
2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的PROG标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的PROG含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
3、检测值范围：0-400ng/ml
4、敏感度：1.0ng/ml