【最小抑菌浓度测定】琼脂稀释法VS肉汤稀释法

稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）是一种评估抗菌剂抑制微生物生长能力的实验技术，主要包括微量稀释法和常量肉汤稀释法两种方法。琼脂稀释法具有操作简便、成本低廉、适合高通量筛选等优势，尤其适合自动化操作和精确控制药物浓度。肉汤稀释法直观、易于操作，适合实验室规模的测试，并且可以根据实验需求调整药物浓度和培养基体积。

琼脂稀释法

1、原理

本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中，然后点种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度(MinimalInhibitoryConcentration，MIC)。本方法适用于不溶性抗（抑）菌产品。

2、操作步骤

（1）抗（抑）菌溶液的配制：以无菌操作取5ml或5g（固体研磨后）样品，放入45ml灭菌磷酸缓冲液中，充分震荡溶解，配成10%的均匀分散的溶液或悬液。

（2）含抗菌剂培养基配制：将已配成10%的抗（抑）菌溶液或悬液用PBS做对倍系列稀释成不同浓度的受试液，置45℃～50℃水浴恒温备用。

（3）双倍浓度培养基配制：称取76gMH琼脂培养基，溶于1000ml水中。加热至沸腾溶解。然后121℃压力蒸汽灭菌15min，置45℃～50℃水浴备用。此培养基将用于稀释抗（抑）菌溶液或悬液。

（4）含抗（抑）菌液培养基的配制：分别取10ml系列稀释的抗菌液加入平皿内。将在45℃～50℃水浴中的双倍MH琼脂培养基10ml，加入平皿内，边加边摇晃平板，使抗（抑）菌液和培养基充分混匀，待凝固后备用。

（5）用加样器取1μl～2μl（含菌量约为107cfu/ml）菌悬液点种于含抗（抑）菌液培养基的平皿，接种后所形成的菌液圈直径约5mm～8mm（每个点菌量约为104cfu）。

（6）以同样方法接种不含抗（抑）菌成分的MH琼脂平板，作为阳性对照。

（7）将接种后的平板放置35℃培养箱中，倒置培养18h～24h，观察结果。

3、评判规定

菌落生长被完全抑制的最低抗（抑）菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计。

营养肉汤稀释法

1、原理

本试验将不同浓度的抑菌剂混合溶解于营养肉汤培养基中，然后接种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度(MinimalInhibitoryConcentration，MIC)。本方法式用于可溶性抑菌产品。

2、操作步骤

（1）按2.1.1.2所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌悬液

（2）含抗菌剂培养基配制：将抗（抑）菌溶液用蒸馏水做对倍系列稀释成不同浓度的受试液，取各稀释度受试液2.5ml加入到含2.5ml双倍浓度营养肉汤的试管中。

（3）取0.1ml含菌量约为108cfu/ml菌悬液接种于含抗（抑）菌剂的营养肉汤的试管中，作为试验组样本。

（4）以同样方法接种不含抗（抑）菌剂的营养肉汤的试管中，作为阳性对照组样本。

（5）取2支含营养肉汤的试管中，作为阴性对照组样本。

（6）将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置37℃培养箱中，培养48h，观察结果。

（7）试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其作用浓度应为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml。

3、评判规定

当阳性对照管有细菌生长(混浊)，阴性对照管无菌生长(透明)，试验用菌悬液的作用浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml时，试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗（抑）菌剂浓度，为该样品对受试菌的MIC。