免疫共沉淀(Co-IP)技术服务

   免疫共沉淀(Co-IP)技术服务

   免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)技术是检测蛋白质间相互作用 的经典方法, 其基本原理是以细胞内源性靶蛋白为诱饵，将靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行共孵育，促进免疫复合物的形成；随后加入能够与抗体Fc段结合的prorein A/G(预先结合固化在琼脂糖小珠上)，形成“结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-proteinA/G小珠”复合物，纯化该复合物后凝胶电泳分离蛋白，应用 Western blot 或者质谱技术鉴定靶蛋白的结合蛋白。

与其它研究方法相比，免疫共沉淀最大的优势在于该体系是在生理条件下检测蛋白质之间的相互作用，因此，不仅可以检测到体内形成的天然复合体，而 且可排除过表达靶蛋白所带来的假阳性。其次内源性的靶蛋白质是完全加工、修饰和成熟的蛋白质，因此，依赖于修饰的蛋白质相互作用也能被检测到。



 一 原理：

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。

每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。