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PCR专题：聚合酶链式反应（PCR）

2016-08-22 1:22 来源：上海远慕生物试剂

PCR技术可用于：（1）检验感染性疾病是否处于隐性或亚临床状态；（2）有效检测癌基因的突变，准确检测癌基因的表达量
PCR技术

实验方法原理	PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
实验材料	模板DNA
试剂、试剂盒	dNTP Taq DNA聚合酶蒸馏水 PCR缓冲液引物氯化镁
仪器、耗材	PCR仪移液枪 PCR板薄壁管离心管离心管盒
实验步骤	一、标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液　 10 ul 4种dNTP混合物　各200 umol/L 引物　　　　　各10～100 pmol 模板DNA 　　　　0.1～2 ug Taq DNA聚合酶　 2.5 u Mg²⁺　　　　　　 1.5 mmol/L 加双或三蒸水至　 100 ul 二、PCR引物设计 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。 1. 引物设计的基本原则（1）引物长度：15-30 bp，常用为20 bp左右。（2）引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。（3）引物内部不应出现互补序列。（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。（5）引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。（6）引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。（7）引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。 2. 引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）*、Oligo6 （引物评价）、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 （在线服务）。三、模板的制备（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。四、PCR反应条件的控制 1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子。 2. 镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。　　 3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。　 4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。　　 5. 引物浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。　 6. 反应温度（1）变性温度和时间95℃，30 s。（2）退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb(10 kb内）。（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T) 7. 循环次数：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。五、PCR的循环参数 1. 预变性（Initial denaturation）模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。 2. 循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 3. 引物退火（Primer annealing）退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。 4. 引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。 5. 循环数大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。 6. 最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。六、PCR步骤 1. DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。 2. 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 3. 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。七、PCR检测 PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。展开
注意事项
其他	一、 PCR反应的关键环节 1. 模板核酸的制备。 2. 引物的质量与特异性。 3. 酶的质量。 4. PCR循环条件。二、 PCR常见问题及对策 1. 假阴性，不出现扩增条带（1）模板原因 ① 模板中含有杂蛋白质。 ② 模板中含有Taq酶抑制剂。 ③ 模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。 ④ 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。 ⑤ 模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。（2）酶失活 ① 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。 ② 忘加Taq酶或溴乙锭。（3）引物 ① 引物质量。 ② 引物的浓度。 ③ 两条引物的浓度是否对称。解决对策： ① 选定一个好的引物合成单位。 ② 引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。 ③ 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。 ④ 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。（4）Mg²⁺浓度 ① 浓度过高降低PCR扩增的特异性。 ② 浓度过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。（5）反应体积的改变 ① 通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定; ② 在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。（6）物理原因 ① 变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性。 ② 退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。 ③ 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度有问题。（7）靶序列变异 ① 靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合。 ② 靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列。 2. 假阳性，出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。（1）引物设计不合适 ① 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性。 ② 靶序列太短或引物太短。（2）靶序列或扩增产物的交叉污染 ① 整个基因组或大片段的交叉污染。解决方案：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。 ② 空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。解决方案：可用巢式PCR方法来减轻或消除。 3. 出现非特异性扩增：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。（1）引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体。（2） Mg²⁺离子浓度过高。（3）退火温度过低。（4） PCR循环次数过多有关。（5）酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。 4. 出现片状拖带或涂抹带（1）原因 ① 酶量过多。 ② 酶的质量差。 ③ dNTP浓度过高。 ④ Mg²⁺浓度过高。 ⑤ 退火温度过低。 ⑥ 循环次数过多引起。（2）对策 ① 减少酶量。 ② 调换另一来源的酶。 ③ 减少dNTP的浓度。 ④ 适当降低Mg²⁺浓度。 ⑤ 增加模板量。 ⑥ 减少循环次数。

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