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高通量测序（NGS）的原理

2016-09-30 1:11 来源：上海远慕生物试剂

高通量测序（NGS）的原理

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高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的桑格测序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。

Solexa的测序原理是可逆终止化学反应。DNA片段加上接头之后，可以随机的附着于玻璃表面（Flow cell），并且在固相的表面经过桥式扩增。这样就形成了数千份相同的单分子簇，被用做测序模板。测序采取边合成边测序的方法，和模板配对的ddNTP原料被添加上去，不配对的ddNTP原料被洗去，成像系统能够捕捉荧光标记的核苷酸。随着DNA 3'端的阻断剂的去除，下一轮的延伸就可以进行。和焦磷酸测序不同，每次DNA的只能延伸一个核苷酸。Solexa的读长在100-150bp之间，适合小RNA鉴定、甲基化和表观遗传学研究。

ABI Solid技术的核心是4种荧光标记寡核苷酸的连接反应测序。测序之前，DNA模板通过乳化PCR扩增，和Roche 454的基本相同，只是Solid的微珠更小，只有1μm。3'端修饰的微珠可以沉淀在玻片上。连接测序所用的底物是8个碱基荧光探针混合物，根据序列的位置，样品DNA就可以被探针标记。DNA连接酶优先连接和模板配对的探针，并引发该位点的荧光信号的产生。Solid的读长只有50-75bp，精确度可达Q40，适于基因组重测序和SNP检测。

三个厂家的高通量测序仪器虽然各具特点，在原理上很多的共同之处：

1 将目标DNA剪切为小片段

2 单个小片段DNA分子结合到固相表面

3 单分子独立扩增

4 每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号

5 高分辨率的成像系统

高通量测序以其高输出量与高解析度的特性，不仅为我们提供了丰富的遗传学信息，而且使得测序的费用和时间大大缩短。在高通量测序发展的过程中，也有很多的问题需要我们去解决：数据在临床诊断上的作用，测序数据的储存和分析，数据的安全和信息隐私等。

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