免疫球蛋白IgG的提取

2016-11-29 16:04 来源：上海远慕生物试剂

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一、目的及要求
了解和掌握免疫球蛋白的提取方法。

二、概念
抗体是在抗原物质刺激下，人或脊椎动物免疫系统的浆细胞产生的，能与抗原发生特异性反应的免疫球蛋白，主要存在于人和动物的血清及其体液中。

三、免疫血清的制备
（一）动物的选择
实验室常用的动物是家兔和羊，有时也用豚鼠或鸡，大量制备商品性抗血清时，可采用马、牛等大动物。对动物的基本要求是：
1、与抗原物质的种属关系越远越好；
2、发育成熟、健壮、体重合乎规定，如家兔要求体重在2～3Kg以上；
3、最好为成年雄性动物，如用雌性动物，则不得用怀孕者。

（二）抗原的种类、质量要求及用量
1、抗原的种类
抗原是决定所制备免疫血清特异性的关键，在免疫前必须进行鉴定。
制备免疫血清的抗原可以分为以下三类：
1）微生物抗原：如细菌、病毒、立克次氏体、螺旋体、真菌等；
2）组织抗原：主要是各种蛋白质或蛋白质复合物，如各种酶类、激素、结缔组织成分、血浆蛋白、肿瘤组织等；
3）免疫球蛋白抗原：这种抗原在免疫荧光和免疫酶技术中应用最广；
2、抗原的纯度
抗原纯度要高，应用病原微生物时，应选择抗原性强、稳定和标准的菌株或毒株。细菌性抗原应避免有培养基成分，培养病毒的组织尽量采用与被免疫动物同种的组织，培养用的生长液也应避免含有抗原性强的物质，用Hank ′s氏液等为好。
3、抗原的用量
抗原量过小，不能有效地刺激机体产生抗体；抗原量过大，也影响抗体的产生，所以抗原量要适当。抗原用量视抗原种类、剂型和注射途径而异。采用弗氏佐剂，剂量较小，一次注射剂量以1mg/kg体重为宜，不加佐剂的剂量要大10倍以上。静脉注射剂量要小些，以免引起动物死亡。

（三）免疫的途径与方法
免疫途径应是多种多样的，如静脉、腹腔、肌肉、皮内、皮下和淋巴结等，但肌肉和皮内两种途径较少应用。目前一般倾向于小剂量、多点、多途径的方法，但具体应视抗原的生物学特性和理化特性来决定。酶、毒素等生物活性抗原，一般不宜采用静脉注射。球蛋白抗原免疫可选用皮下、皮内和肌肉注射。但效价不高，因此大都选用抗原加弗氏佐剂、足掌皮下注射的方法，或者注卡介苗使腘淋巴结肿胀，然后直接注入腘淋巴结内的方法，增强抗体的产生。
足掌注射为近年来常用的免疫途径，能获得相当良好的效果，但剂量不宜过大，一般家兔0.2～0.5mL，否则肿胀严重。有的采用先经足掌内注射卡介苗（后足掌各注 0.2～0.5mL）。10～14d后，腘淋巴结肿大，然后向淋巴结内注射加有完全佐剂的抗原，两侧各0.5mL左右，半个月后再注射不加佐剂的抗原（3mg/mL）皮下或肌肉多点注射，每点0.1mL，总量0.5mL左右、这样免疫效果较为理想。
注射次数可分为一次注射和多次注射两种。一次注射，抗体产生的慢，效价低，但特异性高，如果再次注射，抗体产生的快，效价高，持续时间也较久。多次注射，可得高效价血清，但往往特异性较差．多次免疫的间隔时间，可因抗原性质不同而异。

（四）佐剂
佐剂是一种和抗原一起免疫动物，能增强抗原的免疫原性，加强抗体形成的物质，如明矾、磷酸铝、氢氧化铝、结核分枝杆菌、短小棒状杆菌和细菌内毒素等。
细菌、细胞等颗粒性抗原的免疫原性较好，通常均用其悬液直接免疫，不加佐剂。可溶性抗原，尤其纯化制剂，一般免疫原性较低，应该加入一定的佐剂，以提高其免疫效能。
目前常用弗氏佐剂（Freundt′sadiuvant），其主要成分为羊毛脂、石蜡油和卡介苗所组成。有卡介苗为弗氏完全佐剂，不加卡介苗为弗氏不完全佐剂。弗氏佐剂配方有多种，羊毛脂与石蜡油之比，一般为1︰2（羊毛脂10g加液体石蜡油20mL），也有用1︰3、1︰4甚至1︰9 的，应根据药品质量而定。先将羊毛脂与石蜡油按比例混合好，羊毛脂1份、液体石蜡油2～4份，混匀，高压灭菌，冰箱保存，临用前与等量抗原溶液混和研磨，乳化，即为弗氏不完全佐剂抗原。如在其中加入2～4mg/mL卡介苗（100℃、10min杀菌），则称为弗氏完全佐剂抗原。充分乳化是获得良好免疫效果的关键，如果放置后油水分层，表明乳化不良，滴于水上不扩散为乳化良好．有时可加入1%Tween-80，以加强乳化效果。

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