动物组织中DNA的制备

2016-11-29 16:08 来源：上海远慕生物试剂

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关键词：动物动物组织 DNA制备

（一）原理

DNA是所有生物体的基本组成物质。真核生物DNA主要存在于细胞核中。制备DNA时应将细胞核膜打破方能释放出来。

细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在细胞破碎后，这两种核蛋白将混杂在一起。因此，要制备DNA首先要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol/L NaC1的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小（仅约为在纯水中的1%）；而在l mol/L NaCl的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。

分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，让DNA游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来，获得产品。

当细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶（DNase）立即开始降解DNA，如果在破碎细胞后不及时采取抑制酶活的措施，最后将会得不到任何DNA。为此，如在本实验中加入柠檬酸盐、EDTA等螯合剂以除DNase必需的Mg2＋离子，使DNase活性降低，并要求整个分离制备的过程均在4℃以下进行，以减少DNase的降解作用，最后加入SDS使所有的蛋白质（包括DNase）变性。当然如果希望获得更大分子的DNA时，则在细胞破碎后，及时加入SDS使蛋白质（包括DNase）变性，并加入蛋白酶K，降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸，及时阻止DNase的降解作用。

DNA分子很大、很长，在水中呈黏稠状，但DNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之DNA分子具有刚性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使DNA断裂成碎片。为保证获得大分子DNA，操作时应避免急裂振摇，或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的吸头，不可猛吸猛放，更不能用细的吸头反复吹吸。

大分子DNA的水溶液呈黏稠状，可以用玻璃棒缠起来。液体DNA只要防止DNase污染和高盐浓度条件下能在液体状态保存；抽干后的固体DNA，性质稳定，可长期保存。

生物体内各部位的DNA是相同的，但取材时以含量丰富的部位为主，如动物的肝脏、脾、肾、血液、精子等。所有材料，必须新鲜及时使用，或放入－20℃冰箱或液氮冷冻保存。

DNA的含量及纯度可用紫外吸收法、定磷法及化学法等测定。

（二）试剂及器材

（1） 0.15mol/L NaCl – 0.015mol/L pH7.0柠檬酸钠溶液：称取8.77g NaCl，4.41g柠檬酸三钠（Na3C6H507 · 2H20），用约800ml蒸馏水溶解后，调节pH至7.0，最后定容至1 000ml。

（2） 0.15mol/L NaCl – 0.1mol/L EDTANa2溶液：称取8.77g NaCl，37.2g EDTANa2溶于约800ml蒸馏水中，以NaOH调pH至8.0，最后定容至1 000ml。

（3） 5%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取5g SDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。

（4）氯仿– 异戊醇溶液：按氯仿:异戊醇=24:1配制。

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