葡聚糖凝胶操作步骤及注意事项

2018-02-26 17:24 来源：上海远慕生物试剂

摘要：葡聚糖凝胶(Sephadex)是白色珠状颗粒，由葡聚糖经醚键相互交联聚合而成具有多孔性三度空间网状结构的高分子分离材料，为稳定的亲水性凝胶，在水中和电解质中很容易溶胀。

葡聚糖凝胶指的是由一定平均相对分子质量的葡聚糖(dextran) 和甘油基以醚桥形式相互交联而成，具有立体网状结构，应用面广的一类凝胶，国外商品名为Sephadex。

葡聚糖凝胶操作步骤：
1、乙醇浸泡：在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干。
2、无盐水浸泡：室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀。
3、盐酸浸泡：在常温下再用0.1MHCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗只中性。
4、装柱：层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25;对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。
5、平衡：上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止(流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值)。
6、上样：凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整;脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50cm以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1即可。
7、洗脱方法：可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱;在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化。
8、清洗：每次用完之后，将柱子里的缓冲液置换为去离子水，然后用20%的乙醇封存。
9、在位清洗(CIP)：凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h用0.1M氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。
10、保存：凝胶使用完后，可将其回收，可将凝胶用超纯水冲洗干净并滤干，加入0.02%的叠氮钠做为防腐剂，或者浸泡在20%的乙醇中，防止长菌。

葡聚糖凝胶注意事项：
凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水；洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵；若无此装置，可用控制操作压的办法进行；样品体积不宜过多，最好为床体积的1%～5%，最多不要超过10%；样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。

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