荧光原位杂交（FISH)的实验步骤

  荧光原位杂交（FISH）的基本原理是，按照两个核酸的碱基序列互 补原则，用特殊修饰的核苷酸分子标记 DNA 探针，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或 DNA 纤维切片上，再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合，经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或 DNA 纤维上的 DNA 序列定位、定性和相对定量。实验方法如下：
 
1）玻片处理
 
（a）玻片清洗：热肥皂水刷洗，1% 盐酸浸泡 24 h，再在 0.1% 焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡 24 h。
（b）硅化处理：玻片和盖玻片 1%（质量分数）盐酸煮沸 10 min，烘干，锡纸包好 4 ℃ 保存备用。
（c）明胶涂片制备：将烘干的玻片放入明胶中 10 min，然后 60 ℃ 烘干过夜备用。
（d）试剂瓶、塑料器皿及组织匀浆器的处理试剂瓶、组织匀浆器先清洗干净，用 1 mL/LDEPC（Diethyl Pyrocarbonate）水溶液浸泡处理（37 ℃、2 h，室温过夜），高压消毒去除 DEPC，然后 250 ℃ 烘干 4 h 以上或 200 ℃ 过夜。称量试剂勺也要干烤。塑料器皿最好用灭菌的一次性塑料用品，使用前进行高压消毒。为保证质量，凡使用的枪头、试管等均经 0. 5 mL/L DEPC 水溶液处理 3 h 以上，然后再高压灭菌，烘干。若为进口已处理的无 RNase 和 DNase 的枪头、试管可不必处理直接使用。
 
参照图
 
 
2）样品制备及其所涉及的试剂包括：
 
（a）缓冲溶液：
1 × PBS 缓冲溶液：NaCl 8 g，Na2 HPO4 2.9 g，KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，溶入 1000 mL 超纯水；
3 × PBS 缓冲溶液：NaCl 24 g，Na2 HPO4 8.7 g，KCl 0.6 g，KH2PO4 0.6 g，溶入 1000 mL 超纯水；
通常配制成 10 × PBS 的储备液，3 × PBS 和 1 × PBS 可用 DEPC 水稀释获得。
 
（b）4% 多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）
称取 2 g PFA 加入 30 ml 约 60 ℃ 的热水，滴几滴 20% NaOH 放在磁力搅拌器搅拌至完全溶解。然后向其中加入 16.5 ml 3 × PBS 缓冲液，在冰浴中充分混匀冷却，冷却后，用 HCl 调整至中性（7.2 左右），拿出搅拌子。向 PFA 溶液中加入超纯水，定容在 50 ml。用 0.45 微米的膜过滤后使用。（室温或 4 ℃ 保存备用）。
 
（c）配制 50%，80%，98% 无水乙醇溶液，每个总量 20 mL。
 
（d）DAPI 溶液
用 1 ml ddH2O 将 DAPI 溶解，制得 2.9 mM 的 DAPI 溶液（1 mg DAPI/1 mL H2O）。（DAPI 不能直接用 PBS 等缓冲液溶解，需要先用水将其溶解）。取适量 DAPI 水溶液加到 PBS 中，制备成 10～50 µM 的 DAPI 溶液。
 
（e）各种溶液的配制：凡是水溶性液体均用 1 mL/L DEPC 水配制。
 
注意：
 
    配制时应在通风条件下操作，并避免接触皮肤和吸入（戴手套及口罩），因 PFA 有较强的固定作用及毒性，对粘膜及皮肤有固定及毒性，刺激作用；
    加热时，温度不宜过高，常为 60~65 ℃，否则，PFA 降解失效；
    配制好的 PFA 虽可存放一定时间，但过久的液体，固定效果下降，应尽早使用。
    4% PFA 是目前原位杂交组织化学技术中最常用的固定液，它能较好地保持组织及细胞内的 RNA，同时对形态保持也较好。样品固定时间在 2～3 小时，RNA 含量较为恒定。过度延长固定时间会引起细胞内生物大分子的过度交联，影响探针的穿透力，降低杂交效率。
 
 
3）取样及保存方法
 
（a）反应器沉淀前取样 2～5 mL 至离心管。
（b）离心 （2000 r/min）5 min，去上清液 （加蒸馏水重复两次）。
（c）样品加入 1 mL 多聚甲醛，摇匀，4 ℃ 下放置 3 h。
（d）样品离心（12000r/min）5 min，去上清夜。
（e）加入 1 × PBS，摇匀，离心（10000r/min）5 min，去上清夜 （重复 3 次）。
（f）加 0.5 mL 1 × PBS，0.5 mL 无水乙醇，摇匀，-20 ℃ 保存 （可保存 6 个月）。
 
4）样品固定：
 
稀释样品 3～5 倍，对样品进行超声处理 （3W 超声 2～3 min，沉降 1 min，去沉淀物，5W 超声 5 min），将活性污泥絮体打散成单个细胞以便于显微镜 计数。然后取 3 μL 样品涂于包埋明胶的玻片上 （检查样片本底），37 ℃ 的热烘箱固定 2 h（或者在空气中干燥 2 h 或者过夜）。依次用 50%、80%、98% （质量比）乙醇浸渍 3 min，对细胞进行脱水后，立放，并进行干燥。
 
5）样品杂交
 
实验所涉及的缓冲液包括杂交缓冲液 （Hybridization Buffer, HB）和淋洗缓冲液 （Washing Buffer, WB），其组分如表 1-1 和表 1-2。
 
表 1-1 杂交缓冲液（Hybridization Buffer）
             5%           10%         20%         30%         35%         40% 
0.05%SDS（μL）           1.2          1.2          1.2          1.2          1.2          1.2  
50mMTri-HCl（μL）           24           24           24           24           24           24   
5mol NaCl（mL）        4.32        4.32        4.32        4.32        4.32        4.32
甲酰胺（mL）             1.2          2.4          4.8          7.2          8.4          9.6  
蒸馏水（mL）             18.4548          17.2548          14.8548          12.4548          11.2548          10.0548  
探针              Nsm156         Ntcoc206              Ntspn693              Nsv443          Ntspa662 NSO1225 Nmv           NIT3      
 
表 1-2 淋洗缓冲液（Washing Buffer）
组分              体积      
0.05%SDS              0.6μL     
50m MTri-HCl              12μL      
5mol NaCl            2.16mL  
蒸馏水           42.8274mL    
 
（a）吸取 2 mL 杂交缓冲液遍布在杂交盒内折好的吸水纸上，将已固定好样品的载玻片放入杂交管中，然后在 46 ℃ 杂交炉中放置数分钟。
（b）吸取 10 μL 探针贮存液和 80 μL 杂交缓冲液混合后，用箔纸包好放入 46 ℃ 杂交炉中预热数分钟；探针贮存液浓度为 25 ng/μL，用无菌水稀释购买的探针，实验用的探针序列及杂交条件见表 1-3 所示。
 
表 1-3 用于检测样品中 AOX、NOX 的寡核苷酸探针及杂交条件
 
探针              探针序列(5’～3’)            标记细菌种属              浓度a                
NSO1225              CGCCATTGTATTACGTGTGA             Ammonia oxidizing beta-proteobacteria          35               
Nsv443          CCGTGACCGTTTCGTTCCG        Nitroso-spira, -lobus, -vibrio             30               
Nmv              TCCTCAGAGACTACGCGG         Nitroso-coccus            35               
Ntspa662              GGAATTCCGCGCTCCTCT          Nitrospira             35               
NIT3              CCTGGCTCCATGCTCCG            Nitrobacter           40               
Ntcoc206              CGGTGCGAGCTTGCAAGC         Nitrococcus mobilis             10               
Ntspn693              TTCCCAATATCAACGCATT         Nitrospina gracilis        20               
 
注：
 
（a）表示杂交缓冲液中去离子甲酰胺浓度（%）
（c）吸取 9 μL 预热后的探针稀释液涂于载玻片待测样品上，然后将载玻片迅速地移回杂交管中于 46 ℃ 下进行杂交（黑暗中进行），杂交时间为 2～3 h；
（d）杂交后的洗脱：打开恒温水浴槽，加热到 48 ℃，对杂交缓冲液、淋洗缓冲液进行预热。杂交盒中取出载玻片用杂交缓冲液冲洗样品后，快速放入淋洗缓冲液，48 ℃ 水浴 20 min 后用 4 ℃ 冰水，冲洗样品，样品洁净台中挥干。
 
DAPI 染色
每孔滴 9 uL DAPI，4 ℃ 暗处 5 min，4 ℃ 冰水（BPS 缓冲溶液）冲洗，挥干。用带有 360 nm 激发波长，460 nm 发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全细胞计数。
 
封片
涂封片剂，盖盖玻片，无气泡后指甲油封装。
 
荧光显微镜进行检测
每个样品及每个探针都采集 20 个不同区域。每个区域中的细胞个数要超过 1000 个，然后进行平均以获得每个探针对于每个样品的杂交结果。细菌丰度或细菌数 目（cells/g 或 cells/L）为 AS1/（S2V），其中 A 为视野中细菌平均数；S1 为样品涂抹面积；S2 为视野涂抹面积；V 为样品体积。