远慕生物：小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的测定法

1. 实验原理

染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。大小应为主核的1/20～1/5。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。微核率是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，所以可用简易的、快速、灵敏的微核计数来代替繁杂的畸变染色体计数。Matter 和Schmid建立的微核测试是一种比较理想的方法，目前国内外已把微核测试用于辐射损伤、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。


嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞的核糖体已消失，被染成淡橘红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，由于无核，极易观察到微核，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。


2. 实验对象

成年健康小鼠，体重 25g 左右，雌雄均可。


3. 实验试剂与器材
（1）器材：显微镜、低速离心机、电子天平、解剖器械（搪瓷解剖盘、探针、剪刀、镊子）、注射器、试管、试管架、磨口试剂瓶、滴管、染色缸、洗耳球、量筒、清洁载玻片。
（2）试剂：0.9％生理盐水、灭活的小牛血清、环磷酰胺、甲醇、PBS (pH6.8)、Giemsa染液、瑞氏染液。
 
4. 实验方法与步骤：
（1）环磷酰胺处理：取骨髓前24h先给小鼠腹腔注入环磷酰胺，注射剂量为100mg／kg动物体重。
（2）取骨髓：用损伤脊髓法处死小鼠，然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉，取出大腿骨，用一小块纱布来回搓干净附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨两端膨大的关节头，然后用注射器吸取5ml生理盐水，插入股骨一端，将骨髓细胞冲洗至10ml的离心管中。可重复冲洗多次，直至骨髓腔呈白色为止。
（3）离心处理：将所获得的细胞悬浮液以 1000rpm离心10min，吸去上清液，在沉淀物中加入2滴灭活的小牛血清，制成细胞悬液。
（4）涂片：滴一滴悬液于载玻片一端，按常规方法涂片，在空气中晾干。
（5）固定：将晾干的载玻片放入甲醇固定液中10min，取出晾干。
（6）染色：将制片平放在玻璃板上，用1∶9∶10的 Giemsa∶PBS∶瑞氏染液，染色15min，流水冲洗后晾干即可镜检。
（7）观察：嗜多染红细胞为年幼红细胞，呈灰蓝色，略大于红细胞（红色），微核多呈圆形和椭圆形，呈蓝紫色或紫红色。
（8）结果分析：在显微镜下，每只小鼠骨髓涂片标本计数1000~2000个嗜多染红细胞，包括其中出现微核的细胞数，将结果填入表内，并计算微核细胞率，观察记录结果（表13-2）。
按100mg/kg体重剂量给小鼠腹腔注射环磷酰胺，其嗜多染红细胞微核率为（48.9±3.6）％。正常小鼠嗜多染红细胞微核率为5‰以下，超过5‰为异常。