免疫荧光染色是如何一步步实现「化妆」的呢？

通过免疫荧光对样本进行染色，整个流程和化妆（护肤、妆前乳、底妆、彩妆，和定妆）一样，有五个步骤。免疫荧光染色是如何一步步实现「化妆」的呢？小博同学下面会一一分解（蓝孩子们，听到「化妆」不要打瞌睡嘛，这可是关乎你们毕业大计的宝贵知识哦）。
「基础护肤」--固定样本
和基础护肤的目的一样，固定的目的就是为了长久保持细胞的状态，让样本「容颜永驻」，「宛如生时」。
通过化学试剂处理样本，从而固定细胞结构和蛋白分布。免疫荧光的固定剂可以分为交联类固定剂和有机溶剂类固定剂。交联类固定剂大多采用的是甲醛、多聚甲醛等醛类物质，这一类固定剂通过醛基与蛋白质发生交联反应，形成网络，保持蛋白质的位置和结构，是最常用的固定剂。在少数情况下，可能会用到有机溶剂类固定剂，如甲醇、丙酮等。它们是通过变性蛋白质的方式对组织进行固定。具体使用何种样本固定剂，可查看特定的抗体说明书。（图 1） 「妆前乳」——通透细胞膜
固定好样本的「容貌」之后，为了帮助「化妆品」进入细胞，贴合抗原，需要进行细胞膜通透的步骤。
通透，就是在细胞膜上打孔，使封闭液和抗体能够进入细胞。一般情况下，采用醛类固定剂固定的样本需通透细胞膜，而有机溶剂类固定剂本身就可以通透细胞膜，固定后的细胞不需要再增加通透步骤。通透一般采用表面活性剂 Triton-XTM 100，少数情况下，采用甲醇作为通透剂会得到更好的染色效果。抗体说明书上会标注出合适的通透剂。（图 2） 「底妆」——封闭抗体非特异性结合位点
「底妆」是为了遮盖皮肤的瑕疵，保证后续「妆容」的清爽干净。免疫荧光里，抗体的非特异性结合会导致样本的「妆容」出现瑕疵，需要用「封闭液」上点「底妆」「遮瑕」——封闭掉非特异性结合位点。封闭液一般采用与二抗同来源的血清。
作为「底妆」的封闭液虽然常常扮演幕后英雄的角色，不引人注意，但是，如果封闭液质量不好，孵育抗体之后很可能出现很多杂点，轻则影响美观，重则掩盖抗体的特异性信号，毁掉整个免疫荧光样本。而 Troubleshooting 的时候往往会先从抗体上找原因，兜兜转转换了好多抗体也得不到满意的结果，白白浪费很多时间。所以，不要小看「底妆」对「妆容」的影响，慎选封闭液才能保证「妆容」通透干净。
「彩妆」——孵育一抗/二抗、细胞核复染
经过前面一系列的处理，我们的「模特」已经拥有了无瑕的美肌。下面，让我们期待「模特」的「彩妆」大变身。
化妆时，需「彩妆」修饰妆容，免疫荧光中，则是用抗体标记样本的特点，并添加绚丽的色彩。其中，一抗用来识别样本中的抗原，定位「彩妆」，二抗用来放大信号、增加色彩。
一抗
一抗决定「彩妆」的定位，其特异性和灵敏度是免疫荧光成功与否的关键。如果一抗灵敏度不高，不能体现样本的「上妆」效果，如果特异性不强，「妆容」就会脏兮兮的，哪哪儿都是。更有特异性差的抗体，明明应该识别核蛋白，却在胞质里玩的不亦乐乎，使整个荧光结果「面目全非」。
去哪里才能找到最合适免疫荧光一抗呢？小博经过多年苦心验证，吐血推荐 CST！！！这里的抗体质量稳定，灵敏度高、特异性强，是免疫荧光成功的不二法门。（图 3） 二抗
有的一抗偶联了荧光基团，可以直接为免疫荧光的样本提供绚丽的色彩（图 4）。但是更多的情况下，一抗不带有荧光标记，需要偶联荧光基团的二抗与一抗结合，放大样本信号，并且添加耀眼的「彩妆」效果（图 5）。 选择二抗时除了要与一抗匹配之外，还要考虑荧光基团的颜色、稳定性等因素对成像效果的影响。
1）荧光基团的颜色：每一个荧光基团都有它特定的激发光谱和发射光谱，选择荧光基团的时候，既要考虑实验的需求，也要考虑显微镜的光源和滤光片配置。常见荧光基团的激发光和发射光如下（表 1）所示： 2）荧光基团的稳定性：荧光基团长时间暴露在光下（尤其是显微镜的汞灯、激光器等强光源下），容易发生淬灭。好不容易做好的片子，刚刚在显微镜下调好视野准备拍照，荧光信号就淬灭了，这种感觉就好像花了一早晨时间画了个美美的妆，结果刚出门就赶上一场大雨，「脱妆」了，实在太让人沮丧了。
为了防止「脱妆」，建议选用 Alexa Fluor??系列或 DyLight??系列的荧光基团标记的抗体。这类荧光基团具有更强的信号强度，更好的光稳定性，耐受更广泛的 pH 范围，可以很好地减少荧光淬灭。目前，CST 用于免疫荧光的二抗，都是 Alexa Fluor??系列基团标记的。
细胞核复染
用抗体对样本上完「彩妆」之后，还可以复染细胞核对「妆容」进行修饰。复染的染料也有多种选择（表 2）。
复染可以在二抗孵育后单独进行，也可以采用含有 DAPI 的封片剂直接封片 (#8961)，省略单独复染的步骤。 「定妆」——封片
「彩妆」上完后，不要着急进影棚拍片，还需上点「定妆液」，防止「脱妆」。
免疫荧光样本的「定妆液」是防荧光淬灭的封片液，当然推荐 CST 的 ProLong?? Gold Antifade Reagent (#8961，#9071)，它对荧光淬灭具有很好的抑制效果，可以保持「彩妆」持久靓丽。使用这种封片液时，盖好盖玻片后记得将载玻片放在黑暗处固化 24 hr，达到最佳的防淬灭效果。之后，就可以涂上美美的指甲油进行封片啦。（图 6） 以上，就是一个样本小「模特」成功进阶为免疫荧光界的「吉赛尔·邦臣」的「化妆」大法，有了美艳的「超模」，再配上一点点拍照技巧，您期待的「美艳不可方物」的免疫荧光大片就呼之欲出了。