细胞凋亡 WB 没成功，你是不是用了 RIPA？

样品制备，看你是不是这样做的：

自配裂解液或者购买 RIPA，加上样品研磨啊研磨，孵育啊孵育，然后离心扔掉沉淀（RIPA 不可溶组分），取上清（RIPA 可溶组分）进行下游实验。

对对对！都是这么做啊，扔了取上清！

且慢，我们扔掉了，扔掉了，扔掉了一些啥？要不要紧，影响细胞凋亡的实验结果不？
 

例一 .SU YEON LEE，et al（2010）.Implication of necrosis-linked p53 aggregation in acquired apoptotic resistance to 5-FU in MCF-7 multicellular tumour spheroids. ONCOLOGY REPORTS 24: 73-79, 2010

研究方法

1. MCF-7 细胞培养 4-9 天后，用 RIPA 分别进行蛋白提取，分为 RIPA 可溶性组分和不可溶性组分两组

2. SDS-PAGE 后，立春红染色（图 A），用 WB 分别检测 p53，CuZnSOD，MnSOD，Tubulin

主要发现

MTS 培养过程中，RIPA 不可溶性组分中蛋白增加，可溶性组分和不可溶性组分蛋白图谱有很大差异，胞浆中的 CuZnSOD 和线粒体中的 MnSOD 只存在于 RIPA 可溶性组分中，而 p53 和 tubulin 则在 RIPA 可溶性和不可溶性组分中都存在。这表明，如果仅使用可溶性组分研究目标蛋白的定量，则结论可能是不准确或出现偏颇。

例二．CHO HEE KIM1 et al,(2010).Role of reactive oxygen species-dependent protein aggregation in metabolic stress-induced necrosis. INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 37: 97-102,2010

研究方法

1. MDA-MB231 细胞，分别用 shCon，shSnail 质粒转染，分别培养于普通培养基及 GD 培养基 12 小时

2. 使用 RIPA 提取蛋白，分别将 RIPA 可溶性组分和 RIPA 不可溶性组分进行 Snail, p53, pro-caspase 3, pro-caspase 9, and beclin 1，WB 检测。

主要发现

某些特定刺激诱导凋亡后，P53，caspase3，caspase9 等会聚集在 RIPA 不可溶组分中，不可溶性组分中 P53 和 caspase 9 信号甚至比可溶性组分中更强，表明目标蛋白在 RIPA 不可溶组分中显著丢失。证明 RIPA 并不能提取到真正意义上的总蛋白，丢掉的不可溶组分中还有很多蛋白，甚至是目标蛋白。

例三．Kevin A. Janes,(2016).An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
研究方法

1. MCF10A-5E 人乳腺上皮细胞激活 Fas 死亡受体，无激活组为对照

2. 分别用 NP-40（不含 SDS 和脱氧胆酸盐），RIPA buffer， Laemmil（SB）样品缓冲液提取蛋白

3. WB 进行 Clv-caspase-8 检测, Hsp90,Tubulin，P38 作为对照
主要发现

结果显示，仅在 Laemmil 缓冲液提取的样品中检测到激活形式的 Caspase-8，而使用 NP-40 和 RIPA 提取的蛋白样品中均未检测到。证明了 RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白谱，某些特定蛋白会因刺激方式在可溶性和不可溶性组分之间移动。

 

例四． Zapata et al., （1998）. Granzyme Release and Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.

Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中 caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase 的活性明显下降。

研究方法

1. 分别使用 RIPA 和 2%SDS + 超声提取未激活 T 淋巴细胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴细胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解细胞提取总蛋白

2. WB 进行 caspase-3, caspase-7, parp and GD1 检测

主要发现

p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中却不存在。证明了 RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspase-3 and caspase-7。用 Laemmli 缓冲液加超声处理可进一步从 RIPA 不可溶性组分中提取出蛋白。

这样看了一圈下来，细胞凋亡 WB 没成功的原因，很可能就是因为你用了 RIPA！那下面我们就详细的看一下RIPA 不适合做细胞凋亡 WB 检测的原因有哪些吧!

RIPA 不适合做细胞凋亡 WB 检测的原因:

1. RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspase-3 and caspase-7。

2. RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白谱，目标蛋白及内参蛋白常常会丢失在被丢弃的不可溶组分中，仅使用可溶性组分研究不严谨。

3. RIPA buffer 提取的蛋白图谱偏差会得出错误或偏差结论，特别是涉及目标蛋白的定量问题时。

看了这些例证，是不是有点明白你凋亡研究 WB 为什么没成功了？主要是你的蛋白样品出现了问题，使用 RIPA不严谨，必须要解决蛋白丢失，溶解度差，得到真正意义上完整的蛋白图谱。也许使用柱式法蛋白提取试剂盒，可以帮你解决蛋白丢失问题，得到完整的蛋白图谱.