细胞复苏过程按此步骤操作,原理来也可以如此傲娇

【材料】

1.  常规细胞培养仪器设备恒温水浴振荡器。
2.  培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）

【操作程序】

1.  细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。
2.  培养液、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱37℃预热20min，备用。
3.  二甲基亚砜（DMSO)在40℃冰箱中冷藏30min，备用。
4.  从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
5.  将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。
6.  用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，放培养箱中培养。
7.  记录复苏日期

复苏细胞的注意事项，这个真的很重要，一不小心就会造成小尴尬：

 1.  取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

 2.  冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4.  关于离心问题大约为2种说法：一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液；这种不需要离心，主要是怕离心不当造成细胞损失严重；第二种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体全倒净，且一定倒干净。按照常规的离心分装的方法进行复苏。

5.  细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在有些经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

6.  复苏细胞分装的问题：试验中复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7.  加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长， DMSO的浓度在小于0.5%- 1％都是没有问题的。所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。