动物检疫基因组DNA标准样品的研制方案简介

随着经济全球化进程的加快和进出口贸易的发展，世界各国人员往来、物资交流越来越频繁，境外动物疫病传人我国的危险性和可能性也随之增大。据世界动物卫生组织发表的公报报道，目前全球各种疾病中的60％来自动物，在所有动物引发的各种传染病中，75％的疾病能传染给人。在人类近现代史上，一些人畜共患病曾造成了巨大的灾难，如鼠疫、炭疽、SARS、禽流感等。不少人兽共患病都具有传播快、死亡率高、危害严重等特点，对国民经济的发展和整个社会的稳定都产生极其严重的影响。所以，做好人畜共患病的监测和快速筛选溯源工作，尤其是分子生物学检验技术．是保护人畜生命安全，应对紧急疫情的发生和动态的疫源地疫情监测的有力手段。

核酸检测技术是一大类依据分子生物学原理检测DNA或RNA的技术，1985年聚合基链式反应的发明标志着它的诞生。经过多年发展．核酸检测技术已派生出包括恒温扩增技术和核酸杂交在内的多种方法，在动物检疫领域的病原体检测中得到广泛应用。分子生物学技术检测致病菌需要准确、可溯源的标准样品用于检测方法的研究、确认和验证，核酸标准样品是分子生物学检验技术不可缺少的重要阳性对照物和质控物。因此．核酸标准样品的研制是随着分子生物学检测技术的发展，最近十几年才发展起来的一门新兴产业。核酸标准样品研制的关键技术主要包括大批量高纯度核酸提取、核酸的准确定值、冷冻干燥、均匀性和稳定性分析、溯源性等。

第二节 动物检疫基因组DNA标准样品的研制方案简介

一、国内外研究现状

我国已经研制出和动物检疫有关的致病菌基因组DNA标准样品包括：金黄色葡萄球菌核酸标准样品、阪崎肠杆菌核酸标准样品、溶血性链球菌核酸标准样品、肉毒梭菌核酸标准样品、产气荚膜梭菌核酸标准样品、蜡样芽孢杆菌核酸标准样品、四种致病性大肠埃希氏菌核酸标准样品、空肠弯曲菌核酸标准样品、肠炎沙门氏菌核酸标准样品、副溶血性弧菌I葺核酸标准样品和单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品等。

国际上已经研制出和动物检疫有关的致病菌基因组DNA标准样品包括：欧共体的参考物质和测量研究所(IRMM)研制的单核细胞增生李斯特氏菌基因组核酸标准样品(IRMM- 447)、空肠弯曲菌基因组核酸标准样品(IRMM一448)、大肠埃希氏菌O157：H7基因组核酸标准样品(IRMM一449)。

二、制备基因组DNA标准样品的操作步骤

(一)茵株收集、鉴定和增茵培养

用相应的方法对收集的标准菌株进行增菌培养和生化鉴定、血清凝集和特异性基因片段的PCR扩增实验．结果符合的则用相应的标准方法进行增菌培养。

(二)基固组DNA提取

4℃下离心收集培养好的菌液并用于DNA提取，基因组DNA提取可以用商业化的核酸提取试剂盒．如AB公司生产的PrepManTM Ultra或QIAGEN公司生产的Genmictips 500 /G和Genomic DNA Buffer Set。DNA提取物溶解在pH 8．0的TE缓冲液中，并在一20℃下保存备朋。

用于制备基因组DNA标准样品的DNA相对分子质量应尽可能大，因此核酸提取过程中应特别小心：首先，在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，因此在提取过程中应尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；其次，分子热运动也会减少所抽提到DNA的分子量，所以提取过程也应尽可能在低温下进行；最后．因为细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程使用的玻璃器皿、试剂，离心管等一次性用品都应经过严格的消毒灭菌．破坏核酸酶的活性。另外制备的基因组DNA必须是高纯度的，因此制备的样品必须没有蛋白质和RNA污染，各种离子浓度也应符合要求，这些在基因组DNA制备时都应考虑到。

(三)基因组DNA标准样品制备

1．基因组DNA浓度测定

以λ噬菌体DNA为外标物。采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法测定提取的基因组DNA浓度。对于分析物浓度为50 ng／mL时，PicoGreen DNA分子荧光定量方法测量的变异系数CV=2．4％。PicoGreen DNA分子荧光定量检测步骤为：

(1)DNA标准曲线制备

1)100μg /mL的x噬菌体DNA标准品，用pH 8.0的TE缓冲液稀释成2 μg/mLDNA贮存液。

2)2μg /mL的x噬菌体DNA标准品贮存液按表3-1进行稀释。

3)每个反应孔按表3-1所示．再加入1 mLQuant—iTTM PicoGreen试剂，混匀，在室温避光孵育2 min～5 min。

4)多功能酶标仪检测。

(2)待测样品检测

1)取待测样品溶液5 μL，用pH 8.0的TE缓冲液稀释至1mL加入反应孔中

2)每个反应}L再加入1 mL Quant一iTTM PicoGreen试剂．混匀，在室温避光孵育2 min～5 min。

3)多功能酶标仪检测。

(3)反应参数

多功能酶标仪检测反应参数：激发光480 nm．发射光525 nm。

(4)结果计算

反应结束后，确认标准品和待测样品扣除空白对照后的荧光值。以标准品的荧光值为X坐标轴，标准品的DNA浓度为纵坐标，制作标准曲线。根据待测样品中核酸DNA的荧光吸收值．从DNA标准曲线上，得出待测样品中DNA的浓度。

2．基因组DNA的质量检查

取10．0 μL DNA提取物和PCR扩增产物进行电泳检查．0．8％琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物用1．2％琼脂糖凝胶)，在电压为180 V条件下电泳30 min，电泳条带如果清晰明亮、条带单一、无杂带和RNA，则说明提取的DNA质量很好．核酸具有完整性和高分子量．可以用于核酸标准样品研制。

3．基因组DNA的分装及冷冻干燥

将上述基因组DNA分装于内置微量管的样品套管中，每管DNA含量为50μL，置于冻干机中冷冻干燥，如德国CHRIST公司生产的Christ Epsilon 2-85D冻干机(Chmt Ge-firertrocknungsanIagen GmbH，Osterode am Harz，DE)．使用仪器内部程序ˊ15食品-PCR细菌DNA方法进行冻于。冻干后的样品在无菌条件下密封并加贴唯一性标识，放置于-20℃中避光贮存。

来源：北京标准物质网