远慕实验：免疫组化实验其实也不难

IHC 实验从操作上来讲并不算难，但是由于操作步骤较多，因此造成实验结果不理想的因素较多，曾有人总结出「九九八十一难」，现在我们就 IHC 操作常遇到的一些问题及其解决方法进行汇总，希望能解决你的 IHC 问题。
1. 抗体浓度过高
一抗浓度过高是造成切片染色深常见的原因之一。解决办法是在每次使用新抗体前对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，包括即用型的抗体也同样需要进行测试，不能只简单的按照说明书进行染色。

2. 抗体孵育时间过长或温度较高
为了避免这种情况出现，相关人员应当严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时，而是 30 分钟，因此，要根据染色结果进行调整。

3. DAB 变质和显色时间太长
DAB 最好现用现配，如有沉渣，应进行过滤后再使用。配制好的 DAB 不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与 DAB 产生反应，从而降低 DAB 的效力；像未用完的 DAB 存放在冰箱里，需要的时候再取用的这种行为也是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控，待达到理想的染色程度时，应立即终止反应。
当由于染色片太多或使用染色机，导致无法及时进行终止操作时，也应该尽量对新的，或使用频率不高的抗体，进行显色时的监控，避免显色时间过长。

4. 组织变干
修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。这就要求相关人员在操作过程中要做到仔细认真，并采用 DAKO 笔或 PAP Pen 在组织周围画圈，达到有效的避免液体流失，提高操作速度的效果。

5. 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间大于 24 小时
具体原理不清楚，但现象确实存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在 4oC 冰箱过夜，对结果无明显影响；如果放在室温，特别是炎热的夏天，则会出现背景着色。因此，不可存放时间太长。

6. 一抗变质、质量差的多克隆抗体
由于过期的抗体会导致切片不显色或者背景着色，所以应当注意一抗的有效期。
用新买抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

7. 忘记血清封闭
在免疫组化中使用封闭血清，可以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景。封闭血清一般选择和二抗来源相同的，因此常用山羊血清。有时也会使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不可与一抗来源相同。

8. 操作过程中脱片
（1）可能是黏附载玻片质量的问题，建议尝试更换载玻片。
（2）组织切的不好，可能是切片机刀片较钝造成切片切的厚、不均匀，或者是切片机操作者手法不熟练等。
（3）可能是组织的问题，比如癌症组织有坏死情况时，也容易造成脱片。
（4）烘烤结果不理想，可能是烘烤时间较短或温度不够等。
（5）操作时甩动幅度过猛，有脱片嫌疑的切片最好不甩或轻轻甩，可用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
（6）修复过程出现问题，比如在抗原修复时，高压时间过长，或者放进 100 度修复液时不够平稳，也容易出现脱片的情况。此外，用 EDTA 修复比柠檬酸更容易脱片。

（7）一旦见到有组织漂起来，在操作时就要更加谨慎，使用 PBS 的时候尽量泡，不要冲。