生物样品采集、冻存应注意的问题

    生命科学研究中组学技术的发展以及临床医疗领域新一代检测技术的进步，促进了对生物样品的需求，也促进了生物样品的采集、保存等环节的正规化、规模化。生物样品的保存，不外常温和低温两种方式。常温保存能耗少、环保，有时也非常方便，是一种有潜力的保存方式。一些机构正在积极探索不同的常温保存技术。上海远慕生物也推出了RNAsafety?这种可用于组织的常温采集和保存的试剂。生物样品的低温保存，则是目前较常用的生物样品保存方式。

    生物和医学上的低温，是一个比较宽的温度范围。从大多数酶的zui适反应温度37℃以下到几个K（开尔文），都可以称为低温（绝对零度为-273.15℃ 即0K）。本文从样品保存的角度，将低于常温（室温，25℃左右）的温度理解为低温。低温能抑制生物体的生化活动，这是自然界固有的物理化学规律。根据阿仑尼乌斯（Arrhenius）方程，温度越低，化学反应速度越慢，样品的保存时间越长。因此，为了使生物样品在一定的时间内保持稳定，人们按不同需求将样品保存在4℃，-20℃，-80℃ 或温度更低的冰箱中，或者保存在液氮中。本文谈谈生物样品低温保存尤其是冻存时需要注意的一些问题。

    1. 长期保存的组织样品要尽快冻存

    样品贮存的温度对有效保存时间的影响很大。选择合适的贮存方式和贮存温度很重要。但为了保证实验结果的客观性，研究者也要充分注意样品在贮存或固定前的处置时间和方式。样品从开始收获到固定或低温保存前这段时间，仍有一些生化过程在较快地进行。这些生化反应的速度直到样品被固定或者低温保存时才显著降低。这一段时间越短越好。对于手术切除的组织，热缺血（warm ischemia）时间越短越好；对于实验动物，处死取样时挣扎时间越短越好。这有助于防止因环境改变而导致基因表达水平或蛋白磷酸化状态产生较大变化。一些较复杂的手术可能进行几个小时甚至整天，那么zui先被切割但未被切离的那部分组织可能经历较长的热缺血时间，从而导致较大的生化变化。为了尽可能减少热缺血的影响，一些手术室专门放置了液氮容器，组织一旦切下就被投入液氮进行急冻（snap freezing）；对于耗时较长的手术，有人先在短时间内切下有代表性的小部分组织用于研究，然后再进行耗时较长的切除；有人在条件有限时，采用了将热缺血状态转为冷缺血（cold ischemia ）状态的办法减少样品的变化。他们先把切下的组织置于冰上或4℃ 冰箱中放置短时间，方便时再将样品置于-80 ℃冰箱或液氮保存。总之，从样品开始采集到被冻存或固定，这段时间越短越好，一般不要超过20分钟。当然不同组织生化过程的变化快慢有异。当组织来不及冻存时，可将其剪成小块，放于组织保存液如RNAsafety?中。

    2. 样品冻存的优缺点

    相比于FFPE样品，冻存组织的DNA 和RNA的得率高，片段长，质量好。可用于基因芯片和新一代测序等高通量基因组学检测。不同于FFPE样品，冻存组织内的蛋白质（如酶类）仍然保持生物活性，可用于某些检测。但对冻存样品，需要注意一些问题。冻存组织的形态学检测效果有时不如FFPE样品精细、完美（例如用于免疫组织化学检测时）；某些病理组织内的一些感染性因子冻存后仍然保持活性，处理这些样品时需要格外注意；组织样品中的RNA在-80℃ 冻存时仍然不是长期稳定的，有人观察到5年后RNA出现降解；核酸、蛋白质等大分子经过反复冻融，有可能断裂成较小片段；冻存耗能较多，需要较多专门的空间，成本高昂；当冻存设备发生故障时，大批珍贵的样品有可能被破坏，从而导致巨大的损失；当用液氮冻存样品时，还要防范冻伤、液氮容器爆炸及因空间密闭等导致窒息等风险。

    3. 冻存温度的选择

    前已述及，根据一般的物理化学规律，温度越低，样品的稳定时间越长。在超低温冰箱面世之前，-20℃ 冰箱是常用的低温贮存工具之一。实践证明，-20℃ 时组织内的大分子仍然可以被降解。而且，0至-60℃ 是水的结晶温度。结晶容易对细胞和组织的微观结构造成伤害，一般不在这一温度范围来保存组织和细胞。一些经过提纯的大分子可以在这一温度范围内短期保存。目前，大多数生物和医学研究机构用-80℃ 冰箱或液氮冻存生物样品。-80℃低于危害性较大的结晶温度范围，也是常用设备超低温冰箱能达到的温度。但在-80℃温度下，不同的生物样品的保存时间是不一致的。组织中的DNA可以在-80℃下可以保持数年或更长时间。组织中的RNA在-80℃下的稳定性随不同组织或细胞而异，但一般不超过5年。一些组织内的RNA在-80℃下不到一年就发生了降解。为了长期保存组织内的RNA，可以将组织切成尺寸小于0.5cm 的小块，没入5-10倍体积的RNAsafety?等组织培养液中，置于冻存管内，冰冻保存。RNAsafety?溶液能够较好地维持RNA的完整性。甚至那些已知RNA酶含量较高的组织中的RNA也可以在RNAsafety?保存液中得以长期冻存。

    值得一提的是，为了避免因反复冻融引起组织内RNA的断裂，有些研究者在短时间保存样品时，采用组织保存液4℃保存，而不采用冻存法。

    为了保持生物大分子的活性，也可以采用更低的温度保存样品。-137℃是水的玻璃化转变温度。在这个温度以下，生化活动极大降低。因此，制冷温度可达-140℃至-150℃的深低温冰箱，以及液氮，成为一部分研究者的选择。液氮贮存在液氮罐中时，为了避免气化的部分引起爆炸，液氮罐口常保留一定缝隙。但这个缝隙也导致了液氮液面和液氮罐口之间形成一个温度梯度（-80℃至-196℃，可认为气相氮温度在-150℃左右）。为了避免样本间的交叉污染，有些研究者倾向把样品置于气相中而不是液相中。但要注意液氮罐口的温度是否达到了目标温度。还要注意液氮的消耗状况和操作液氮罐的安全问题。

    随着制冷技术的进步，深低温冰箱已经出现在某些实验室。这类冰箱制冷温度可达到-150℃。它不需要像液氮罐那样需要频繁监控液氮消耗情况。箱内温度也比较均匀恒定，但深低温冰箱降温速度低于液氮，一旦开启取放样品时容易造成较大范围的温度波动，温度恢复时间也相对较长。另外深低温冰箱能耗很大，且必须保障供电。

    有些生物样品的保存需要更低的温度。液氮的液相部分可提供-196℃ 的低温。样本内的生化活动在此温度下几乎停止，样本可以得到长期保存。液氮保存是样品内细胞活性、组织器官的复杂结构及活性zui有效的长期保存方法。液氮保存被生物、医学实验室广泛应用。液氮液相保存样品需要防止样品间交叉污染，要注意冻存管的选用，也要注意安全问题。

    干冰在生物可用于生物样品的短时间内的保存或运输。干冰自身温度-78.5℃，呈固态，不渗漏，气化后无毒，适于样品的保存和运输。但干冰只能在短时间内维持样本的低温，它自身不用于生物样本的长期保存。另外，干冰的购买和伴随运输会产生一定的额外费用。在此我们建议在合适的情况下采用诸如之RNAsafety?类的化学保护剂代替干冰，进行样品的采集和运输。

    4. 结语

    生物样品的低温保存，是目前生物样品的主要保存方式。在哪一温度下进行保存，需要结合样品本身的性质及实验目的来确定。一般来说，组织样品内的大分子比纯化后的大分子不稳定，RNA比DNA更易降解。组织样品、细胞样品的迅速采集、迅速冻存或固定对于保存生物大分子的完整性很重要。在进行样品的低温保存时，辅以生物样品保存液，例如RNAsafety?系列化学保护剂，可以帮助延缓大分子的降解进程，得到较理想的研究结果。