ATPase染色液(钙钴法)实验步骤

2020-05-29 14:05 来源：上海远慕生物试剂

产品名称：ATPase染色液(钙钴法)
供应商：远慕生物
规格：5×50ml
保存：4℃,避光,6个月

三磷酸腺苷酶( adenosine triphosphatase，ATPase)是一种水解酶，是催化ATP合成的一种酶。三磷酸腺苷酶根据所用激活剂、抑制剂以及酶定位的不同分为膜性三磷酸腺苷酶、肌球蛋白三磷酸腺苷酶、线粒体三磷酸腺苷酶等。ATPase能水解三磷酸腺苷为磷酸腺苷和磷酸，此酶只作用于磷酸与磷酸之间的高能键，因而释放大量能量。其催化反应如下：A-P-P-P + H2O→A-P-P + H3PO4 +能量
ATPase染色(钙钴法)原理在于三磷酸腺苷酶水解三磷酸腺苷为二磷腺苷和磷酸，磷酸根与钙离子结合为磷酸钙沉淀，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色硫化钴沉淀。

产品组成：
名称：Storage
规格：5×50ml
试剂(A): 钙盐溶液       50ml        RT 避光
试剂(B): ATPase孵育液       50ml        4℃ 避光
试剂(C): 硝酸钴溶液     50ml        RT
试剂(D): 中性福尔马林       50ml        RT
试剂(E): ALP硫化溶液        2×1ml      RT 避光
试剂(F): ATPase对照液       10ml        4℃ 避光
使用说明书      1份

自备材料:
1、蒸馏水
2、恒温箱

操作步骤(仅供参考)：
(一)石蜡切片染色
1、石蜡切片脱蜡后，入蒸馏水。
2、入钙盐溶液中，37℃温箱5min。
3、入ATPase孵育液，孵育2～4h。
4、蒸馏水洗1min。
5、入硝酸钴溶液5min，入蒸馏水。
6、入中性福尔马林，室温固定2min。
7、流水冲洗2min。
8、在上述过程中配制ALP硫化工作液，即取试剂(E)用蒸馏水稀释50倍, 即为ALP硫化
工作液，即配即用。切片入硫化工作液，孵育2min。
9、流水洗10min后，入蒸馏水。
10、石蜡切片经95%乙醇溶液及无水乙醇脱水。
11、二甲苯透明，树胶封片。

(二)冰冻切片染色
1、冰冻切片直接入蒸馏水。
2、入钙盐溶液中，37℃温箱5min。
3、入ATPase孵育液，孵育40min。
4、蒸馏水洗1min。
5、入硝酸钴溶液5min，入蒸馏水。
6、入中性福尔马林，室温固定2min。
7、流水冲洗2min。
8、在上述过程中配制ALP硫化工作液，即取试剂(E)用蒸馏水稀释50倍, 即为ALP硫化
工作液，即配即用。切片入硫化工作液，孵育2min。
9、流水洗10min后，入蒸馏水。
10、甘油明胶封固。

染色结果：
酶所在阳性部位黑色硫化钴沉淀

阴性对照(可选)：
1、取对照切片，用试剂(F)-ATPase对照液进行孵育，并与用ATPase孵育液孵育的切片进
行比较。两者反应相同部位可能有非特异性磷酸(单酯)酶存在，两者不同部位才是ATP酶活
性所在。
2、将切片入80℃蒸馏水10min，再与其他组织切片同时孵育，结果应为阴性。

注意事项：
1、 ALP孵育液、ALP硫化液易失效，最好分成小分储存，一经开启立即使用。
2、 ALP硫化液具有腐蚀性和刺激性气味，应小心操作。
3、对冰冻切片染色时，应减少切片在室温暴露的时间。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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