正在做流式实验的进来了解一下！

01、流式的染色条件？一般推荐室温避光染色20分钟，或4℃染色30分钟。具体请参照抗体说明书。

02、流式抗体偶联荧光素的方式？

包括直接标记和间接标记两种。在条件允许的范围内，尽量用直接标记的抗体。如果选择了间接标记的抗体，一抗是纯化的抗人的一抗，那么用纯化的一抗和荧光标记的二抗。如：一抗是小鼠源的抗人的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）。胞内因子染色，用直接标记荧光染料的抗体。

03、如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道，怎么办？

如果需要做5个指标，而流式细胞仪只能做4个通道，可以将指标归成2类，再将样本分成2份，分别检测。比如需要同时检测CD3/CD4/CD8/IL-4/IFN-γ，那么将样本分成两份，第1份加CD3/CD4/CD8/IL-4，而第2份加CD3/CD4/CD8/IFN-γ。

04、什么是同型对照？和FMO区别是什么？

同型对照：用于确定抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，主要是考虑了细胞的自发荧光、Fc受体介导的非特异性结合等因素。对流式不是非常熟悉，做流式胞内实验，检测指标的特异性不高等几种情况下，必须搭配同型对照。

荧光扣除对照(Fluorescence Minus One, FMO):又称染色缺一对照，在抗原表达弱或者多色实验时（＞4色）使用，可以反映抗体组合中其他通道荧光的渗漏，确定阳性细胞的阈值，可作为设门的依据。

05、如何选择同型对照？

与染色的单克隆抗体：

1）相同种属来源

2）相同免疫球蛋白及亚型

3）相同荧光素标记

4）相同剂量和浓度

5）最好来自于同一家公司

06、流式设门要考虑哪些因素？

排除细胞碎片；进行死活鉴定；应用合适的阴性对照；分群不明显的，根据同型对照和FMO圈出阳性比例；查阅文献了解阳性比例。

07、Fc受体封闭

单核细胞、B细胞、DC细胞、NK、巨噬细胞、粒细胞、肿瘤细胞等高表达 FcR，在检测这些细胞时，会与抗体的Fc段非特异性结合，产生假阳性信号。因此，流式检测这些细胞时，推荐使用相应物种的血清或者商品化的Fc受体封闭剂。

08、7AAD单染管调节补偿，如何猝死细胞？

一般是加热65℃处理一分钟。

09、流式抗体可以做免疫荧光吗？

理论上是可以的。抗体的浓度需要自己去摸索，以流式抗体的用量为参考。对于表达弱的抗原，抗体标记的荧光强度不够，需要选择荧光强度高的染料。直接标记的流式抗体容易淬灭，建议染色后马上在荧光显微镜下观察结果。

10、什么是补偿微球？

由于荧光光谱的重叠现象，在进行流式多色分析时，必须设置单染管进行荧光补偿调节。对于初学者来说，补偿调节是流式细胞术中比较难掌握的操作，尤其是遇到一些不太常见的指标，需要经验丰富的流式操作者根据多年的经验判断来调节补偿，才可以得到比较好的数据。

补偿微球大小和淋巴细胞相当，可连接各种荧光标记的抗体来调节补偿。可以像待测的样本细胞一样在相同的实验条件下固定，破膜等，操作起来简单方便，结果准确。克服了以往做三色以上的流式分析时补偿难调，耗费样本（往往用待测样本单标来进行补偿调节），专业要求高等缺点。

11、染色指数是什么？

染色指数（SI）可用于比较不同荧光染料在流式细胞术应用中荧光亮度的差异。该值通过使用阳性区域的平均荧光强度（MFI）减去阴性区域的平均荧光强度得到的差值，再除以两倍的阴性区域标准差获得。染色指数越大，荧光强度越高。进行抗体滴度的时候，根据染色指数来选择最佳的抗体用量。

12、除PI之外，还有哪些常见的核酸染料？

1）7AAD，488nm激光器激发，用PerCP通道；

2）DAPI，蓝色荧光染料，355和405nm激光器激发；

3）Hochest33342, 蓝色荧光染料，355nm激光器激发。

13、胞内细胞因子检测，如何处理细胞？

细胞因子必须被诱导分泌才可以用流式细胞术检测到。常用的刺激剂包括PMA、ionomycin、LPS、CD3/CD28，同时加入莫能菌素和BFA阻断剂，防止细胞因子分泌到胞外。刺激剂的种类，浓度和刺激时间都可以影响细胞因子分泌的水平。

14、为什么会产生高背景和噪音？

实验中有噪音和高背景可能有以下几个原因，如PMT电压设置不当、死细胞和碎片干扰、荧光信号的溢漏，细胞具有较强的自发荧光等。

15、在单染管调节补偿时候，为什么串联染料不可以用相同荧光素不同标记来替代调补偿？

串联染料的抗体光谱不完全相同，会导致错误的补偿。