那些年我们踩过的免疫荧光的坑~

总是会看到人家提取的细胞，拍的漂漂亮亮的图片，在面前晃，然而，轮到自己，发现并不是准备细胞—固定细胞—细胞通透—封闭—上一抗—上二抗-染核-镜检这么简单，后来发现，不要50个字都可以形容出来的实验步鄹，却这么难。。。

五点建议让你避开免疫荧光的坑，美美的show一把自己的成果，也对的起因为实验掉的大把的头发了。
1.考虑抗体的建议稀释度，以实现高的信背比。若抗体浓度过低，则荧光信号较弱，可能难以与背景区分开，但抗体浓度过高，则会导致较高的背景染色。”

2.利用生理溶液来洗涤，可去除未结合的荧光试剂，或那些只是粘在目标上而非特异性结合的荧光试剂，从而提高信背比。

3.荧光物质必须在建议温度下小心保存，并始终注意避光，以保护其光谱完整性。

4.在设计多重实验时，应考虑每种荧光基团的独特性质，如最大吸收波长和最大发射波长，消光系数和斯托克斯位移等因素一定要让您的试剂和使用的仪器匹配；

5.一定要有对照，原代细胞免疫荧光实验中，一般建议使用不表达目标的细胞或组织作为阴性对照。而荧光Western blot或ELISA技术中，含有目标抗原的蛋白或肽段适合作为阳性对照。

一些常见的坑：

一．信号弱或无信号，染色细胞过少可以考虑以下几点：

1.目标蛋白在细胞中没有表达

解决办法：制备细胞裂解液，用 Western Blo tting 验证目标蛋白在细胞中是否表达

2.表达目标蛋白的细胞过少

解决办法：标本中使用更多的细胞，试用其他瞬 时转染方法，或者使用稳定转染细胞系

3.细胞通透性差

增加通透剂作用的时间或者浓度，或 改用其它的通透剂

4.染色前的固定步骤破坏了抗原表位

改用其他固定方法

5.抗体问题

抗体不适合，抗体选择错误或者抗体稀释不标准也会导致无信号，建议按标准稀释，同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释比例，

二.视野中细胞不细胞之间存在散在的发光点：

答：：1，拍照时 PBS 量过少引起的非特异性；

PBS 未过滤，未溶解的残渣黏附而导致

三．镜下观察只有 DAPI 的蓝光，目的荧光几乎没有或者很弱？

出现这种现象很有可能是抗体比例太低，需提高抗体浓度，可配合提高二抗 浓度；共聚焦的激发荧光强度丌够大；二抗孵育时是否是对应的种属。

四．细胞核周围总是存在有一些蓝色的小点点？

此种情况一般是支原体污染所致，建议用杀支原体药2周后再检测，或者通过提高共聚焦机器背景值来覆盖支原体荧光。