Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒操作步骤

中文名称：Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒
产品规格：100T
分类：细胞染色
用途：流式细胞术检测细胞凋亡与细胞坏死
注意事项：Hoechst33258是一种荧光染料,可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料,对细胞的毒性较低。Propidium Iodide简称PI,又称碘化丙啶,对人体有刺激性。Hoechst33258能被活细胞摄取,与DNA结合,在紫外线下呈蓝色荧光。PI使死细胞着色产生红色荧光。在散点图上结果为：正常细胞呈低蓝/红光,凋亡细胞呈高蓝/低红光,坏死细胞呈低蓝/高红光。
储存条件：—20℃,避光,12个月

产品简介：
Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒(Hoechst 33258/PI Apoptotis Assay Kit)是一种采用Hoechst 33258和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双荧光染色方法进行细胞周期与细胞坏死分析的检测试剂盒。单纯的PI染色能够观察DNA直方图上凋亡细胞的亚G1峰，但只能代表G0/G1期发生凋亡，无法观察S期和G2期发生的细胞凋亡，而且细胞经过固定后无法对活细胞和死细胞进行区分。Hoechst 33258可以穿透细胞膜，进入正常细胞和凋亡细胞与DNA结合，能在紫外线下显示蓝色荧光，而且染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。PI不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，PI可以穿透细胞膜使坏死细胞着色产生红色荧光。

Hoechst 33258/PI双染后，可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在二元直方图上，正常细胞对Hoechst33258具有拒染性，呈弱蓝色荧光＋弱红色荧光(Hoechst 33258+/PI+)；凋亡细胞对Hoechst33258具有嗜染性，呈强蓝色荧光+弱红色荧光(Hoechst 33258 /PI+)；坏死细胞对PI具有嗜染性，呈弱蓝色荧光＋强红色荧光。本试剂盒亦可用荧光显微镜进行观察，检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。


自备材料：
胰蛋白酶消化液
流式细胞仪或荧光显微镜
PBS
细胞计数板


操作步骤(仅供参考)：
1、细胞样品的制备：
⑴贴壁细胞：
①小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内备用。
②用胰蛋白酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
③收集上述细胞悬液到离心管内，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl培养液，以免吸走细胞。
④加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底。
⑤小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

⑵悬浮细胞：
①4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl培养液，以免吸走细胞。
②加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底。
③小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

2、配制Cell Stain Buffer工作液：取适量Cell Stain Buffer(2×)与无菌去离子水或蒸馏水等比例混合，即为Cell Stain Buffer工作液，4℃保存备用。

3、重悬细胞：取上述收集好的0.1～1×106细胞，加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。

4、Hoechst 33258/PI染色：
⑴一步法：加入5μl Hoechst 33258 Stain和5μl PI Stain，轻轻混匀， 置于冰浴或4℃，孵育20～30min。
⑵两步法：
①加入5μl Hoechst 33258 Stain，置于37℃水浴，孵育5～15min
②置于冰水中冷却后，4℃ 1000g离心3～5min，使细胞沉到管底，弃上层染色液。
③加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。
④加入5μl PI Stain， 置于冰浴或4℃，孵育20～30min。


5、检测与分析：用流式细胞仪在激发波长400～500nm检测蓝色荧光，在大于630nm处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用荧光显微镜检测，检测前4℃ 1000g离心3～5min沉淀细胞，用PBS洗涤一次，再涂片观察红色荧光和蓝色荧光。对于贴壁细胞使用荧光显微镜检测，亦可不收集细胞，弃培养液后直接依次按照上述比例加入试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)，冰浴或4℃染色20～30min。染色后PBS洗涤一次，再在荧光显微镜下观察。

染色结果：在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，正常细胞呈低蓝光/低红光，凋亡细胞呈高蓝光/低红光，坏死细胞呈低蓝光/高红光。

注意事项：
荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。
在为了获得细胞沉淀的离心的过程中，对于特殊细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当提高离心力或延长离心时间。
Heochst 33258与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min以内。太长容易引起Heochst 33258的发射光谱由蓝光向红光迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变。
如果用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测，则必须把组织消化后，制备成单细胞悬液，才可以进行检测
PI对人体有刺激性，请注意适当防护。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。