神经HRP示踪显色液(DAB法)操作步骤

产品名称：神经HRP示踪显色液(DAB法)
规格：50T
分类：神经染色
储存条件：4℃,避光,6个月
用途：神经HRP示踪DAB(四甲基联苯胺)显色。
注意事项：主要由DAB孵育液、双氧水、乙酸钠缓冲液等组成,染色后呈棕色。

简介：上个世纪70年代，Kristensopn和Olsson报道了HRP可经神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，经组织化学方法可显示出神经元的轮廓，从而开发出HRP追踪神经元示踪技术，即为HRP法。DAB即3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride,是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀，该棕色沉淀不溶于水和乙醇，显色后呈棕色，可在显微镜下观察。神经HRP示踪显色液(DAB法)是动物经麻醉、注入HRP后，游离或络合型的HRP不氧化剂反应生成络合物，该络合物氧化供氢的DAB显色剂，呈棕色，在显微镜下清晰可见。该显色液仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

操作步骤(仅供参考)：
(一)、准备工作
1、动物麻醉：多用(3.5%)戊巴比妥钠作为麻醉剂，大鼠的麻醉剂量为0.25-0.35ml/100g。
2、导入HRP：有压力注射法、电泳法以及周围神经系统的注射涂抹等法。
3、确定动物存活期。
4、动物灌注：麻醉后，经左心室升主动脉插管行心内灌注固定。先用生理盐水或PBS快速灌注。随后用4%的多聚甲醛固定液灌注，先快后慢，时间控制在30-40min。最后用10%蔗糖磷酸缓冲液(pH7.4)。
5、取材：取组织置于20%的蔗糖磷酸盐缓冲液中，切片厚度40μm，存于蔗糖磷酸盐缓冲液备用。

(二)、显色反应
1、配制DAB孵育液：取适量的DABassaybuffer和DAB显色液，按DABassaybuffer：DAB显色液=39:1的比例混合，即为DAB孵育液，即配即用，不宜保存。
2、配制DAB显色工作液：取适量的DAB孵育液和DAB增强剂，按DAB孵育液：DAB增强剂=2000～8000：1的比例混合(具体比例应根据具体时间摸索确定)，即为DAB显色工作液，即配即用，不宜保存。
3、配制1×DABWashbuffer：取适量的DABWashbuffer(20×)，按DABWashbuffer：蒸馏水=1:19的比例混合，即为1×DABWashbuffer。室温保存，6月有效。
4、切片用蒸馏水清洗3次，每次2min。
5、切片入10mlDAB孵育液(提前20℃温育)，避光孵育20min，其间不断晃动。
6、切片入10mlDAB显色工作液(提前20℃温育)，避光孵育20min，其间不断晃动。
7、漂洗：取10ml左右的1×DABWashbuffer漂洗切片2-3次，每次5min。
8、贴片，载玻片用铬明矾明胶包被，室温空气干燥。
9、脱水、透明步骤按如下操作：①蒸馏水10s②70%乙醇10s③95%乙醇10s④100%乙醇2次，每次10s⑤二甲苯2次，每次2～5min。
10、中性树胶封片，显微镜下观察棕色反应。

注意事项：
1.如果出现高的反应背景或沉淀,表明DAB底物反应过于强烈。
2.所用器皿必须洁净,避免含有氧化剂或还原剂,否则会产生非特异性反应。
3.DAB显色液避免反复冻融,以免显色效率下降。
4.DAB增强剂注意密闭保存,否则显色效率下降。