JM109感受态细胞操作步骤

产品储存
1.感受态细胞必须用干冰运输，融化后的感受态细胞不能再冻结储存。如果用户收到感受态细胞后发现泡沫箱中的干冰已经挥发殆尽，应予以拒收。
2.收到感受态细胞后应立即储存在-70℃以下的冰箱中，在6个月内使用不影响转化效率；感受态细胞不可反复冻融，不要与限制性内切酶等经常使用的分子生物学试剂放在一起，避免因温度的波动而影响的效率。

JM109菌株介绍
基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac-proAB）/F’[traD36，proAB ，lacIq，lacZΔM15]。 特 点： 本菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。

质量标准    
1. 使用1 ng pUC19 Plasmid质粒DNA转化100 ?l Competent Cells DH5α测试，产生的菌落数 ＞1×108 transformants/1?g pUC19 Plasmid 。            
2. β-半乳糖苷酶、α-互补性的确认：对E.coli Competent Cells JM109使用pUC19 DNA进行转化后，在含有100 ?g/ml的Ampicillin、40?g/ml的X-Gal的L-琼脂平板培养基上，产生蓝色菌落。
3. 100 ?l的E.coli Competent Cells JM109在含有 100 ?g/ml Ampicillin的L-琼脂平板培养基上过夜培养40 hr不产生菌落。

用户需自备的试剂与物品
1. 试剂：LB液体与固体培养基、抗生素。
2. 物品：弯头玻棒铺菌器、碎冰、水浴锅、超净工作台、摇床、移液器与无菌枪头、无菌1.5ml离心管、台式小量离心机（可配1.5ml离心管和2ml离心管的转子）。
3. 筛选蓝白斑所需：X-gal、IPTG。

使用前准备
1. 感受态细胞从-80℃取出立即置于冰上冻融，将水浴锅温度设置为42℃或将相应抗生素平板温育至37℃。
2. 相应抗生素溶液、24mg/ml的IPTG溶液及20mg/ml的X-gal溶液。注意20mg/ml的X-gal溶液要避光保存。

常规操作
1.从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上融化,如需分装可将刚融化的细胞悬 液分装到无菌预冷的离心管中,再置于冰浴中。
 一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100 μl,可以根据实际情况分装使用。应注意所用 DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以100ul感受态细胞为例。
2.向感受态细胞悬液中加入目的DNA(1-10 ng,且体积<10 ?l),轻轻旋转离 心管以混匀内容物,冰浴30分钟。
转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大时反而会降低转化效率。转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分之一。  
3. 将离心管置于42℃水浴中90秒，迅速将管转移到冰上3分钟。注意该过程不要摇动离心管。
4. 向离心管中加入900 μl 无菌LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养1 小时（160-220 转/分钟）。 该步骤的目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5. 将已转化的感受态细胞低速离心（5000 rpm, 4分钟）后弃掉部分上清，保留100-150μl培养基，用移液器轻轻吹打悬浮菌体后，全部加到含相应抗生素的LB 固体琼脂培养基上，或含X-gal、IPTG及相应抗生素的LB琼脂平板表面，用无菌弯头玻棒铺菌器将细胞均匀涂开。
如果预计的单克隆数量较多，可省略离心步骤，直接取200-300μl转化产物涂布平板（过多的菌液涂布可能会使单克隆菌落粘连在一起，难以挑取）。涂布后剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布至新的平板上。
 6. 将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16 小时可出现单菌落或蓝白斑。  简易操作步骤 此步骤不适用某些抗生素抗性的质粒（比如卡那霉素抗性），若出现转化异常，请用常规步骤操作。

简易操作步骤
此步骤不适用某些抗生素抗性的质粒(比如卡那霉素抗性),若出现转化异常,请用常规 步骤操作。
1. 将选择性固体培养基放于培养箱中预热至 37℃。
2. 从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上融化,如需分装可将刚融化的细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，在置于冰浴中。
3.向感受态细胞悬液中加入目的 DNA(1-10 ng,且体积<10 ?l),轻轻旋转离 心管以混匀内容物,冰浴3-5分钟。
转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大时反而会降低转化效率。转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分之一。  
4. 取已转化的感受态细胞直接涂布到预热至37℃含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上，或含X-gal、IPTG及相应抗生素的LB琼脂平板表面，用无菌弯头玻棒铺菌器将细胞均匀涂开。
5. 将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16 小时可出现单菌落或蓝白斑。